Kann man kaufen oder selbst herstellen.
Die Taq-Polymerase dürfte eines der am meisten verwendeten Enzyme in biowissenschaftlichen Laboren sein – und bei Preisen von einigen Cent pro Unit für das reine Enzym, oder noch deutlich mehr für Taq-Mastermixe, auch ein erheblicher Kostenfaktor. Zwischen 5.000 und 10.000 US-Dollar verbrauchte etwa die Gruppe des Bioingenieurs Michael Lynch von der Duke University in Durham, USA, pro Jahr für die Taq-Polymerase – bis es ihr zu viel wurde und sie sich ein einfaches Protokoll ausdachte, mit dem sie die Taq selbst herstellen konnte.
Seit der erstmaligen Klonierung des Taq-Gens vor etwas mehr als dreißig Jahren wurde die Expression und Reinigung des Enzyms zwar stetig optimiert. Die Protokolle sind aber immer noch sehr arbeitsintensiv und erfordern großvolumige Kulturansätze. Lynchs Team hat die Prozedur jedoch mit ein paar smarten Tricks aus der synthetischen Biologie deutlich verschlankt.
Lästige Benzonase
Als Basis dient ein Autoinduktionssystem, das die heterologe Expression der Taq-Polymerase in E.-coli-Zellen ankurbelt, sobald Phosphat in dem verwendeten Kulturmedium zur Neige geht. Für den Aufschluss der Zellen muss kein Lysozym zugegeben werden, da dieses gleich mitproduziert wird – genauso wie die bakterielle Endonuklease Benzonase, die unerwünschte Nukleinsäuren des Wirts beseitigt.
Zunächst ging die Gruppe davon aus, dass es nach der automatischen Lyse reichen würde, das Lysat eine halbe Stunde auf 70 Grad Celsius zu erhitzen und danach zu zentrifugieren, um unerwünschte Proteine sowie die Benzonase zu entfernen. Ganz so einfach war die Sache aber dann doch nicht, denn die Benzonase, die man zuletzt in einer PCR mit dabei haben will, wurden Lynchs Mitarbeiter damit nicht los.
Die US-Amerikaner versuchten es deshalb zunächst mit etwas verschärften Bedingungen und erhitzten das Lysat in Gegenwart von 0,1 M NaOH. Danach war aber nicht nur die Benzonase mausetot, sondern auch die Taq-Polymerase. Auch die Reduktion von Disulfid-Bindungen der Benzonase mit Beta-Mercaptoethanol brachte nur mäßigen Erfolg und legte die Endonuklease nicht vollständig lahm. Schlussendlich mutierte das Team die Benzonase, die hierauf nur noch hitzelabile Monomere bildete statt hitzestabiler Dimere.
95 Prozent rein
Um die eigene Taq mit dem Protokoll der Gruppe zu produzieren, impft man fünf Milliliter LB-Medium mit einer E.-coli-Kolonie, die das Taq-Plasmid enthält, und zieht die Vorkultur über Nacht bei 37 °C an. Anschließend überimpft man 200 Mikroliter in 20 Milliliter Autoinduktionsmedium und lässt die Bakterien einen Tag bei 37 °C wachsen. Danach zentrifugiert man sie ab und resuspendiert sie in einem Zehntel Volumen Lysepuffer. Optional kann man hiervon 1,5-ml-Aliquots einfrieren. Die resuspendierten Zellen werden eine Stunde eingefroren und danach eine Stunde bei 60 °C sowie zwei weitere Stunden bei 37°C inkubiert, um die komplette Lyse und DNA/RNA-Hydrolyse sicherzustellen. Nach der Lyse werden die Proben kurz abzentrifugiert.
Das Lysat versetzt man danach mit Präzipitationspuffer sowie Beta-Mercaptoethanol bis zu einer Endkonzentration von 0,5 M und erhitzt den Ansatz eine Stunde auf 80 °C. Hierdurch werden alle Proteine außer der Taq denaturiert und gefällt. Anschließend zentrifugiert man. Die im Überstand gelöste Taq wird mit Lagerungspuffer versetzt und schließlich bei -20 °C eingefroren.
Nach etwa einer Stunde Handarbeit erhält man eine zu 95 Prozent reine Taq ohne jegliche Endonuklease-Aktivität, die in Routine-PCRs und qPCRs tadellos funktioniert.
Andrea Pitzschke
Menacho-Melgar R. et al. (2021): Instant Taq: Rapid autoinducible expression and chromatography-free purification of Taq polymerase. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.09.25.461774
Bild: Bioron Life Science