Glyoxal ist vielseitig verwendbar
Dass aus den Daten von RNA-Sequenzierungen viel mehr herauszuholen ist, wenn man die RNA tausender Einzelzellen sequenziert statt die gesamte RNA aller Zellen (bulk RNA), ist unbestritten. Mit der Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) kann man Zelltypen, deren unterschiedliche Differenzierungswege und zelluläre Antworten unterscheiden.
Die Protokolle für die scRNA-seq variieren zwar, die einzelnen Schritte sind aber immer gleich: Die Zellen werden zunächst vereinzelt und lysiert. Anschließend schreibt man die RNA in cDNA-Bibliotheken um, amplifiziert diese und sequenziert schließlich die mit einem Barcode versehene cDNA. Die Sache hat aber einen Haken: Für die scRNA-seq muss man an die mRNA der Einzelzellen herankommen, ohne zelluläre Prozesse zu beeinflussen, die zum Beispiel Genexpressionsmuster verändern können.
Beliebtes Dialdehyd
Michael Boutros und seine Kollegen aus der Abteilung Signalwege und Funktionelle Genomik vom Deutschen Krebsforschungszentrum (DKFZ) in Heidelberg suchten deshalb nach einer Fixierungsmethode für das Transkriptom, die eine Vereinzelung der Zellen ohne Abstriche an Ausbeute und Qualität der RNA ermöglicht. Bei den bisher hierzu eingesetzten Verfahren, wie zum Beispiel dem nuc-seq (single nuclei RNA sequencing), wird der Zustand der Zellen durch Schockgefrieren des Gewebes quasi eingefroren. Durch die Beschränkung auf Zellkerne ist die RNA-Ausbeute aber eher dürftig.
Die Heidelberger um Boutros lösten das Problem mithilfe des simplen Dialdehyds Glyoxal, das in der Immunohistochemie sehr beliebt ist und als weniger toxische, schneller fixierende Alternative zum Klassiker Paraformaldehyd eingesetzt wird. Glyoxal ist klein und bildet bei niedrigen pH-Werten keine ungewollten Quervernetzungen.
Eine Stunde auf Eis
Als Untersuchungsobjekte für die Glyoxal-Fixierung verwendeten die Forscher die unter Drosophila-Fans verbreitete (embryonale) Zelllinie Kc167 sowie humane HEK-293T-Zellen. Zur Fixierung werden fünf Millionen Zellen in 1 Milliliter dreiprozentiger Glyoxal-Lösung (pH 4) für eine Stunde auf Eis inkubiert. Anschließend zentrifugiert man das Ganze, wäscht die pelettierten Zellen zweimal in PBS und fängt sie mit einem Sieb (40 oder 20 Mikrometer) auf. Das weitere Protokoll folgt dem Drop-seq-Prozedere, bei dem Zellen mit barcodierten Kügelchen in winzigen (PDMS-)Tröpfchen verpackt werden.
Die Fixierung muss rasch und vollständig vonstatten gehen, um keine RNA-Moleküle zu verlieren, die aus dem Zytoplasma durch noch offene Membranporen schlüpfen (RNA leakage). Diesen Verlust kann man indirekt anhand des Verhältnisses Intron-haltiger und fertig gespleißter RNA messen. Lecke Zellen verlieren vornehmlich gespleißte Transkripte, da die Intron-haltigen doppelt verriegelt im Zellkern sitzen. Das Verhältnis cytoplasmischer versus mitochondrialer RNA-Sequenzen ist ein ähnlich aussagekräftiger Indikator.
Bei Drosophila-Proben funktionierte die Glyoxal-Fixierung besonders gut, Glyoxal- und nichtfixierte Proben waren hinsichtlich RNA-Qualität und -Reinheit sehr ähnlich. Die humane Zelllinie schnitt weniger gut, aber akzeptabel ab, mit teilweisem RNA leakage und RNA-Abbau.
Gemischte Zellen
Vom Fixierungsprozedere bekommen die Zellen kaum etwas mit, wie Analysen von Pseudobulk-Daten zeigten. Dazu wurden scRNA-Daten fixierter beziehungsweise unbehandelter Zellen digital wieder gepoolt und die hundert höchst-exprimierten Gene bestimmt. Bei Drosophila war die Überlappung 95 zu 100, bei Humanzellen 90 zu 100. Zur Kontrolle, ob die Zellvereinzelung überhaupt gelungen war und die RNA-Sequenzdaten tatsächlich von einzelnen Zellen stammten, setzten die Forscher einen pfiffigen Trick ein. Sie mischten eingangs Fliegen- und Humanzellen eins zu eins und bestimmten den Anteil von Einzelzell-RNA-Daten doppelter Herkunft.
Noch taugt das Protokoll nur für Proben von Zellen, die aus kleineren Klümpchen vereinzelt werden müssen. In weiteren Experimenten wollen die Heidelberger aber untersuchen, ob sich nicht vielleicht sogar Glyoxal-fixiertes Gewebe in Einzelzellen zerlegen ließe, aus denen man brauchbare scRNA-seq-Daten gewinnen könnte.
Andrea Pitzschke
Bageritz J. et al. (2021): Glyoxal as alternative fixative for single cell RNA sequencing. BioRxiv, DOI: 10.1101/2021.06.06.447272
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