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Energietransfer verrät Virus

(26.05.2021) Mit FRET-Assays lassen sich nicht nur Protein-Protein-Interaktionen untersuchen, sondern auch SARS-CoV-2 Antigene nachweisen.
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Beim Fluoreszenz- beziehungsweise Förster-Resonanz­energietransfer (FRET) überträgt ein angeregtes Donor-Fluorophor Energie auf ein nur wenige dutzend Ångström entferntes Akzeptor-Fluorophor, wodurch Letzteres fluoresziert. Verwendet man langlebige Lanthanoid-Fluorophore als Donor, wie etwa Europium, kann man mit der zeitauf­gelösten FRET (TR-FRET) Anregung und Emission von Donor- und Akzeptor-Fluorphor nach Abklingen der kurzlebigen Hintergrund­fluoreszenz messen.

Jussi Hepojoki und seine Kollegen von der Universität Helsinki entwickelten in den letzten Jahren schon verschiedene Immuno­assays zur Antikörper-Detektion, die auf dem zeitauf­gelösten Förster-Resonanz­energietransfer basieren. Die Technik funktioniert aber genauso auch für den Nachweis von Antigenen, wie die Finnen am Beispiel eines SARS-CoV-2-Nachweises demonstrieren.

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Brücke für Transfer

Das Prinzip besteht darin, ein nachzu­weisendes Antigen als Brücke zu verwenden (siehe Abbildung), das Donor- und Akzeptor-Fluorophor so nahe zusammen­führt, dass der Energie­transfer stattfinden kann. Das ist zum Beispiel dann der Fall, wenn zwei markierte Antikörper an unter­schiedliche Regionen des selben Antigens binden - oder sich zwei Antigene einander nähern, an denen mit Donor- beziehungs­weise Akzeptor-Fluorophor markierte Antikörper anhaften.

Für den TR-FRET-Assay von SARS-CoV-2 markierte die Gruppe polyklonale Antikörper gegen das Nukleo­protein (NP) sowie gegen die Rezeptor­bindedomäne (RBD) des Spike-Proteins von SARS-CoV-2 mit Europium (Donor) sowie Alexa Fluor 647 (Akzeptor). Um die Puffer­bedingungen und Konzen­trationen zu optimieren, verwendeten die Finnen zunächst rekombinante RBD- und NP-Antigene sowie Viren aus Zellkultur-Überständen. Am geeignetsten erwies sich ein mit BSA versetzter sogenannter RIPA-Puffer, der meist in Radioimmuno-Präzipitations-Assays eingesetzt wird. Die darin enthaltenen Detergenzien (1% NP-40 und 0,1% SDS) zerstören die Hülle von Viren und machen sie hierdurch unschädlich.

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Für Hochdurchsatz geeignet

Die finnische Gruppe erzielte maximale FRET-Signale, wenn sie rekombinante Antigene und die dazuge­hörigen Antikörper in equimolarer Konzentration verwendete. Der optimierte Reaktions­ansatz enthält 10 Mikroliter Antikörper­lösung (24 nM, aus gleichen Teilen Eu- und AF 647-markierter Antikörper), die mit 10 Mikroliter Proben­lösung eines Nasenraum-Abstrichs gemischt wird. Die Fluoreszenz­messung (Donor bei 616 nm, Akzeptor bei 656 nm) in einem Platten­lesegerät erfolgt fünf bis sechzig Minuten nach dem Mischen.

Der SARS-CoV-2-Test mit der TR-FRET-Technik ist zwar nicht so leicht auszuführen, wie ein einfacher Antigen-Schnelltest und erfordert entsprechende Geräte. Dafür ist er aber auch für den Hoch­durchsatz geeignet und kann beispielsweise in 384-Well-Platten durchgeführt werden. Bei Analysen von Patienten-Abstrichen konnten die Finnen mit dem TR-FRET-Test SARS-CoV-2-Antigene in Proben nachweisen, die in qPCR-Tests einen Schwellen­wertzyklus (Ct) von unter 25 aufwiesen. Damit war er deutlich sensitiver als ein zum Vergleich ausgeführter Immunoblot.

Andrea Pitzschke

Rusanen J. et al. (2021): A generic, scalable, and rapid Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer-based assay for antigen detection SARS-CoV-2 as a Proof of Concept. Mbio, 12(3):e00902-21

Bild: Rusanen et al.

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Letzte Änderungen: 26.05.2021

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