Aktivitätsmessung ohne Firlefanz

Welche Pipettiertechnik passt am besten zur Anwendung?

Luftpolsterpipette oder Mehrfachdispenser – mit den Systemen von BRAND treffen Sie die richtige Wahl mehr

Die Calcium-Bildgebung ist ein Standard­werkzeug für die indirekte Messung der Aktivität und Dynamik neuronaler Netzwerke. Um Verän­derungen auf Netzwerk-Ebene in kultivierten Neuronen zu unter­suchen, wird die neuronale Aktivität oft durch externe elektrische oder opto­genetische Stimulation angekurbelt und mithilfe von Multi­elektroden-Arrays oder Bildgebungs-Verfahren gemessen. Mit diesen Techniken sind zwar detaillierte Netzwerk-Analysen möglich: Multi­elektroden-Arrays sind jedoch auf Einzelzell-Ebene nicht präzise genug und zudem technisch sehr anspruchsvoll. Der Synapsen-Spezialist und Nobelpreis­träger Thomas Südhof von der Stanford University School of Medicine in Kalifornien suchte deshalb zusammen mit seinem Mitarbeiter Zijun Sun eine einfache Alternative. Die beiden entwi­ckelten schließlich ein einfaches Ca²⁺-Imaging-Protokoll, das ohne externe Stimulation auskommt.

Q2 EVOLVE epromo von INTEGRA

Gewinnen Sie ein limitiertes, individuell bedrucktes EVOLVE-Starterpaket mit manuellen Pipetten von INTEGRA mehr

Von Stammzellen zu Neuronen

Bei der Ca²⁺-Bildgebung werden mithilfe von GCaMP-Calcium-Indikatoren intra­zelluläre Ca²⁺-Ströme gemessen, die durch neuronale Depolarisation und Aktions­potentiale ausgelöst werden. Auch Südhof und Sun wählten diesen Weg. Sie kultivierten H1 embryonale Stammzellen, die sie zu induzierten humanen Neuronen umwandelten (Trans­differenzierung). Die Induktion der humanen Neuronen erfolgte mit Tetracyclin-Trans­aktivator mithilfe eines Lentivirus-Vektors. Gleichzeitig infizierten die Forscher die H1 embryonalen Stamm­zellen mit einem weiteren Vektor, der GCaMP6m unter der Kontrolle des humanen Synapsin-1-Promotors exprimierte.

Nach vier Tagen dissoziierten Südhof und Sun die Zellen und säten sie auf Deckgläsern in 24-Well-Platten aus, auf die sie 24 bis 48 Stunden zuvor Maus-Gliazellen plattiert hatten. Die Co-Kultur aus Neuronen und Gliazellen kultivierten sie noch etwa einen Monat weiter, nach 35 bis 40 Tagen starteten die Forscher mit der Ca²⁺-Bildgebung. Dazu wuschen sie die Deckgläser zunächst in einer Elektrolyt-Lösung mit physio­logischer Zusammen­setzung (Tyrode-Lösung) und über­führten sie danach in eine weitere Well-Platte mit Ca²⁺-Imaging-Puffer. Für die Aufnahmen der Signale verwendeten die beiden ein Epifluo­reszenz-Mikroskop. Mithilfe eines selbst entwickelten Matlab-Algorithmus nahm das Duo die Fluores­zenzsignale der Neuronen-Somata in Abhängigkeit von der Zeit auf und wertete die Daten aus.

Einfach die Konzentration erhöhen

Im ersten Ansatz tauchten von den induzierten Neuronen nur vereinzelt und gele­gentlich spontane Ca²⁺-Spitzen auf. Auch feuerten selten zwei oder mehr Neuronen gleichzeitig. Dieses Problem lösten Südhof und Sun, indem sie die Konzen­trationen von Ca²⁺ und K⁺ im Puffer erhöhten. Bei einer Konzen­tration von 4 mM beziehungs­weise 8 mM konnten sie vermehrte synchrone Burst-Ereignisse beobachten. Eine externe Stimulation, um synchrone Ca²⁺-Spitzen auszulösen, war demzufolge nicht notwendig.

Als Nächstes quantifizierten die zwei Forscher die synchrone Feuer­aktivität der Neuronen. Dazu analysierten sie die synchronen Ca²⁺-Spitzen innerhalb des Neuronen-Netzwerks, die durch abgefeuerte Aktions­potentiale ausgelöst werden. Die synchrone Feuerrate definierten die beiden als Anzahl der synchronen Ca²⁺-Spitzen pro Minute. Die Wissen­schaftler verglichen die Netzwerk-Aktivität in der Zellkultur unter verschie­denen Bedingungen: In Tyrode-Medium bei physio­logischen Konditionen sowie in Imaging-Medium, das erhöhte Ca²⁺- (4mM) und K⁺- (8mM) Konzen­trationen enthielt. Mit dem Ergebnis, dass die synchrone Feuerrate in der Imaging-Lösung wesentlich höher war als in Tyrode-Medium. Südhof und Sun schauten sich deshalb den Variations­koeffizienten an, der aus dem Verhältnis der Standard­abweichung der Feuerrate zu ihrem Mittelwert in einem Bildaus­schnitt resultiert. Der Variations­koeffizient unterschied sich nicht signifikant zwischen den beiden Kultur­bedingungen: die Netzwerk-Aktivität war also unter beiden Kultur­bedingungen mehr oder weniger gleich.

Netzwerk-Aktivität gedrosselt

Das Imaging-Medium verstärkte demnach die Feuerrate der einzelnen Neuronen, ohne die synchrone Netzwerk-Aktivität zu beein­flussen. Letztere untersuchte das Forscher-Duo im nächsten Experiment. Sie versetzten die Zellkultur mit 10 µM des AMPA-Glutamat­rezeptor-Antagonisten CNQX und beobachteten anschließend die synchrone Feuerrate. CNQX drosselte die Netzwerk-Aktivität erheblich. Dies war zu erwarten: Ngn2-induzierte humane Neuronen bestehen fast ausschließlich aus exzitatorischen Neuronen; AMPA-Glutamat­rezeptoren sind in diesen die am häufigsten vorkommenden Neuro­transmitter-Rezeptoren. Mit dem Na⁺-Kanalblocker Tetrodotoxin gelang es den Wissen­schaftlern, die synchrone Netzwerk-Aktivität sogar ganz zu blockieren, die Ca²⁺-Spitzen verschwanden hierdurch vollständig.

Fehlte nur noch die Validierung des neuen Ca²⁺-Imaging-Protokolls. Das Forscher-Duo wählte hierzu eine gut charakterisierte Mutation, welche die synaptische Transmission beein­trächtigt. Munc18-1 spielt eine zentrale Rolle bei der Fusion synaptischer Vesikel. In Kindern verursacht die Munc18-1-Deletion das sogenannte Ohtahara-Syndrom, eine schwer­wiegende neurolo­gische Entwick­lungsstörung. Südhof und Sun erzeugten Ngn2-Neuronen mit konditioneller Munc18-1-Deletion und exprimierten in diesen zusätzlich zu GCaMP6m die Cre-Rekombinase, um die Munc18-1-Deletion zu induzieren.

Gestörte Kommunikation

Die Ca²⁺-Spitzen waren in den mutierten Neuronen nur etwa halb so stark wie in den Kontrollen. Interes­santerweise reduzierte die Deletion in einzelnen Neuronen die Signal­amplitude um etwa 30 Prozent, führte aber zu einem markanten Anstieg der Ca²⁺-Signal­frequenz. Diese vermehrten Ca²⁺-Spikes waren überwiegend asynchron. Die Forscher erklären dies mit aberranten Ca²⁺-Spitzen in den mutierten Neuronen, die durch die unter­drückte synchrone Feuer­aktivität hervor­gerufen werden. Offen­sichtlich ist die synaptische Kommuni­kation durch die Munc18-1-Deletion gestört.

In einem weiteren Experiment unter­suchten die kalifor­nischen Forscher corticale Neuronen, die aus neuge­borenen Mäusen mit einer konditio­nellen Deletion aller drei Neurexine (Pan-Neurexin-Deletion) stammten. Neurexine sind präsynaptische Adhäsions­moleküle, die eine Schlüssel­funktion bei der Regulation von Synapsen spielen. Die Deletion aller Neurexine führt zu erheblichen Störungen der synaptischen Kommunikation.

Entsprechend beobachteten Südhof und Sun eine schwächere synchrone Feuerrate in den Deletions­mutanten. Interes­santerweise verursachte die Pan-Neurexin-Deletion jedoch bei einzelnen Neuronen einen signifikanten Anstieg der Ca²⁺-Spitzen-Amplitude. Im Gegensatz hierzu traten Ca²⁺-Spitzen in Pan-Neurexin-Deletions­neuronen deutlich seltener auf. Das neue Ca²⁺-Imaging-Protokoll kann also nicht nur mutante Phänotypen erkennen, sondern auch zwischen verschiedenen Phänotypen unterscheiden.

Miriam Colindres

Sun Z. & Südhof T. (2020): A simple Ca²⁺-imaging approach to neural network analysis in cultured neurons. BioRxiv, DOI: 10.1101/2020.08.09.243576

Bild: Pixabay/ColiN00B