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Sprudelnde Schüttel­kulturen

(22.07.2020) Auch Routinearbeiten wie das Abflammen von Kultur­flaschen zur Proben­entnahme können unerwartete Auswirkungen auf E. coli und Co. haben.
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160 Jahre ist es her, dass Emil Erlenmeyer seinen berühmten Kolben erfand. Chemiker sprangen sofort auf, und seit 1933 machen sich auch Mikro­biologen „Erlis“ zur Anzucht aerober Schüttel­kulturen zunutze. Egal ob Pilz oder Bakterium, 10-ml- oder 5-Liter-Kultur, das Prinzip ist immer gleich: Kolben mit Medium befüllen, animpfen, schütteln. Die Zellen sollen sich vermehren bzw. gewünschte Substanzen produzieren. Um den perfekten Ernte- oder Induktions­zeitpunkt abzupassen, wird zwischen­durch häufiger optische Dichte, Proteinprofil und Ähnliches an steril gezogenen Proben untersucht.

Selbst wenn Routinierte das Prozedere – abflammen, Stopfen abnehmen, abflammen, Probe ziehen, abflammen, Stopfen drauf und zurück auf den Schüttler – in Sekunden­schnelle absolvieren, geht die vorüber­gehende Umwelt­änderung an den Mikro­organismen nicht spurlos vorbei. Ein Team der University of Tsukuba in Japan hat untersucht, wie sich die CO2-Konzen­tration erhöht und was das für verschiedene Kulturen bedeutet.

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CO2 im Kolbenhals

Das beim Abflammen (Verbrennen von Methan) entstehende CO2 wandert teilweise in den Kolbenhals. Je länger das dauert und je schräger der Kolben gehalten wird, desto mehr CO2 kommt drinnen an. Binnen 20 Sekunden kann die CO2-Konzen­tration im Flaschenhals locker auf 2 % steigen; das Maximum mit 9 % CO2 liegt nach 90 Sekunden vor. Die Japaner haben beobachtet und in mathe­matischen Modellen simuliert, wie das CO2 in die schräg gehaltene Kultur­flüssigkeit wandert. Von der flammenden Hitze dagegen kommt außer im unmittel­baren Kolben­randbereich nichts in der Kultur an.

Um zu sehen, ob sich die CO2-Zufuhr auf die Mikro­organismen auswirkt, pusteten die Forscher reines CO2 mit einer eigens konstruierten Automatic Aeration Flask System (AAFS) Unit in Kultur­flüssigkeiten von oben durch den Stopfen hinein. Temperatur­effekte blendeten die Forscher auf diese Weise aus.

Die Kolben waren am unteren Rand mit einem wasser­dichten Ausgang ausgestattet, welcher als Anschluss zur Circulation Direct Monitoring and Sampling System (CDMSS) Unit, einer Art Drei-Wege-Hahn, diente. Von den drei Wegen stellt einer den Anschluss zur Kultur dar; der andere führt über einen Sterilfilter zu einer Spritze, die im Normal­zustand aufgezogen ist und als Druck­regulator dient. Der dritte Weg ist der Ausgang, aus der Proben­flüssigkeit mit einer „Auffang­spritze“ abgezogen wird.

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Non-stop Probenentnahme

Probenentnahme ohne Unterbrechung des Schüttelns geht folgender­maßen (und ist im „Supplementary“-Teil des Papers grafisch dargestellt): Auffang­spritze anstecken, Hahn in Richtung Regulier­spritze drehen, Auffang­spritze aufziehen, Hahn in Richtung Auffang­spritze drehen, die Regulier­spritze reindrücken, so dass durch Volumen­verdrängung Kultur­medium in der Sammel­spritze landet. Jetzt wird der Hahn wieder in Ursprungs­position gestellt, die Auffangs­pritze kann abgenommen und zum Beispiel in ein Eppi entleert werden.

Als Kulturmedium verwendete Hideki Aoyagis Team den jeweiligen Klassiker, d. h. LB für E. coli, R2A für P. saccharophila, NBRC no.804 für A. pasteurianus und YM für S. cerevisiae. Proben­entnahme frisch inokulierter Kulturen erfolgte im 2-Stunden-Takt sowie nach 15, 25 und 35 Stunden, um OD sowie pH-Wert zu messen.

E.-coli-Kulturen zeigten sich im Wachstum unbe­eindruckt vom Sprudel­zusatz, jedoch änderte sich der zeitliche pH-Verlauf. Normaler­weise sinkt der pH in den ersten 10 Stunden allmählich (von pH 7 auf unter pH 6), um daraufhin flott wieder hinauf­zuklettern und sich irgendwann bei pH > 8 einzupendeln. In CO2-begasten Kulturen war die Kletterei langsamer, vermutlich aufgrund einer Puffer­wirkung (CO2 liegt bei pH 6,3 hauptsächlich als Hydrogencarbonat vor). S. cerevisae dagegen ist völlig schnuppe, was in seiner Umgebung passiert; OD-Anstieg und pH-Verlauf waren identisch zur Kontroll­kultur. A pasteurianus und P. saccharophila wuchsen jedoch deutlich schneller, wenn sie einen Schuss CO2 bekamen. Ihr pH-Verlauf dagegen bleibt unverändert.

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System zum Nachbauen

Die Story aus Japan ist Warnung, Hinweis auf Mani­pulations­möglichkeiten und Bastel­anleitung zugleich. Einerseits zeigt sie, wie einflussreich vermeint­liche Routine­handgriffe auf ein Experi­mentier­ergebnis sein können. Je nach Mikro­organismus kann es gehörige Unterschiede – positive wie negative – auf Ausbeute bestimmter Metabolite und Entwicklung machen, ob eine TA alle Proben in Serie zieht – häufig, selten oder (un)regelmäßig, oder zwischen­durch ein bedächtiger Praktikant aushilft. Das Wissen um spezifische Verhaltens­änderungen bei CO2-Begasung wiederum bietet die Möglichkeit, gezielt einzugreifen. Zu guter Letzt ist die gebastelte CDMSS-Unit einen Nachbau wert, um sich das aufwendige und Variation-einbringende Abflamm­prozedere zu schenken.

Andrea Pitzschke

Takahashi M. et al. (2020): Analysis of the influence of flame sterilization included in sampling operations on shake-flask cultures of microorganisms. Scientific Reports, 10:10385

Foto: Pixabay/Republica


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Letzte Änderungen: 17.07.2020

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