Beim Genome-Editing mit CRISPR/Cas ist Präzision das A und O. Die Genschere muss exakt am vorgegebenen Ort schneiden, um Off-target-Effekte zu vermeiden, und sollte die Schnittstelle möglichst schnell finden. Diesen bisher noch immer nicht ganz erfüllten Forderungen kommt die „very fast CRISPR“-Technik (vfCRISPR) sehr nahe, die sich Taekjip Has Gruppe von der Johns-Hopkins-Universität ausdachte.
Sein Team konstruierte hierzu einen mit Licht aktivierbaren Cas9-guide-RNA-Komplex. Es nahm hierbei aber nicht Cas9 ins Visier, sondern die guideRNA (gRNA). Bei der Standard-CRISPR-Technik verwendet man eine single guide RNA (sgRNA), welche die zwei separaten RNAs des natürlichen CRISPR-Systems, crispr RNA (crRNA) sowie transactivating CRISPR RNA (tracrRNA), in einem chimären Molekül vereint.
Doppelstrang destabilisiert
Das Gen-Editing funktioniert aber auch mit den einzelnen Komponenten: Die tracrRNA bildet eine Stem-loop-Struktur und bringt Cas9 huckepack an die von der crRNA vorgegebene Stelle. Die crRNA erkennt die etwa zwanzig Nukleotide lange Zielsequenz (Protospacer), die neben dem sogenannten Protospacer-Adjacent Motif (PAM) liegen muss, das meist aus zwei Guaninen sowie einer beliebigen Base besteht.
Die an ihr Ziel geleitete Cas9 erkennt die PAM-Sequenz und destabilisiert hierdurch den DNA-Doppelstrang. Hierauf hybridisiert die crRNA mit dem Ziel-Strang, wodurch der Doppelstrang aufgewunden wird. Cas9 kann die beiden DNA-Stränge aber erst schneiden, wenn die Ziel-DNA vollständig aufgedröselt ist. Dies nutzte Has Gruppe für das vfCRISPR-System aus. Seine Mitarbeiter ersetzten drei, weit von der PAM-Sequenz entfernte Uracil-Reste der crRNA, durch Licht-sensitive Nukleotid-Derivate. Zusammen mit einer tracrRNA bildet diese eine sogenannte caged gRNA (cgRNA), die Cas9 wie normale sgRNAs zur Zielsequenz führt. Der cgRNA-Cas9-Komplex bindet an die anvisierte Zielsequenz, Cas9 kann sie aber nicht schneiden, weil die Nukleotid-Derivate der cgRNA die vollständige Entwindung der Ziel-DNA sterisch behindern.
Laser löst Blockade
Die sterische Blockade lässt sich jedoch durch Bestrahlung mit Laserlicht aufheben – der hierdurch aktivierte cgRNA-Cas9-Komplex zerschneidet die Zielsequenz in wenigen Sekunden. Bei vfCRISPR-Experimenten in HEK293-Zellen zerlegte das cgRNA-Cas9-Duo innerhalb von 30 Sekunden nach der Bestrahlung mit Laserlicht die Hälfte der Ziel-DNA.
vfCRISPR ist aber nicht nur ein neues Gen-Editing-Werkzeug. Man kann die Technik auch einsetzen, um sich genauer anzuschauen, wie Doppelstrangbrüche entstehen und repariert werden. Hierzu setzte die Gruppe die sogenannte trChIP-Sequenzierung (time-resolved chromatin immunoprecipitation followed by sequencing) ein. Sie verfolgte mit ihr unter anderem, wie das Histon-Protein H2AX nach einem Doppelstrangbruch zunehmend in seine phosphorylierte Version γ-H2AX übergeht. γ-H2AX rekrutiert DNA-Reparatur-Proteine und dient auch als Indikator für DNA-Schäden. Has Mitarbeiter untersuchten die Cas9-Schnittstelle sowie die etwa fünf Mb rechts und links davon gelegenen Sequenzen. Eine Stunde nach der Licht-Aktivierung des cgRNA-Cas9-Komplexes stellten sie eine zunehmende Phosphorylierung von H2AX fest. Diese begann schon nach fünf Minuten unmittelbar an der DNA-Schnittstelle und breitete sich in abgeschwächter Form mit einem Tempo von 150 kb pro Minute in beide Richtungen aus.
Mit Live-Cell-Imaging-Experimenten untersuchte Has Team die Dynamik der DNA-Reparatur. Dazu exprimierte es Cas9-eGFP sowie den Reparaturfaktor 53BP1-mCherry in U2OS-Zellen und transfizierte diese mit einer cgRNA gegen das Gen PPP1R2. Nach der Licht-Aktivierung der cgRNA traten die GFP-Signale vorwiegend in der Ziel-Region auf und 53BP1 nahm seine Arbeit auf. Offensichtlich nimmt es sich dabei immer wieder eine Auszeit und führt unterschiedlich lange Reparaturzyklen durch.
Andrea Pitzschke
Foto: Pixabay/kpr2
Liu Y. et al. (2020): Very fast CRISPR on demand. Science, 368(6496):1265-9