Die von Münchs Team an der Goethe-Universität Frankfurt entwickelte Multiplexed Enhanced Protein Dynamics (mePROD)-Methode verbessert die Sensitivität von Massenspektrometrie-(MS)-Analysen sehr elegant. Und zwar, indem sie das SILAC-Verfahren, bei dem naszierende Peptidketten mit stabilen Aminosäure-Isotopen markiert werden (stable isotope labeling by amino acids in cell culture), mit einer nicht-gepulsten (gesättigten) Peptid-Markierung ergänzt. Kombiniert wird das Ganze mit der sogenannten Tandem-Mass-Tag (TMT)-Markierung, die eine Analyse von bis zu elf Proben gleichzeitig erlaubt (Multiplexing).
Bei der TMT-Markierung werden isobare Tags als Marker verwendet, die nach dem Trypsin-Verdau an Lysin-Gruppen der Proteine angehängt werden. Die Tags haben insgesamt die gleiche Masse, die Verteilung der schweren Isotope auf den Tags ist jedoch unterschiedlich. Ein TMT-Tag mit schwerem Kopf und leichtem Schwanz ist vor der MS nicht von einem mit leichtem Kopf und schwerem Schwanz zu unterscheiden. Die Unterschiede treten erst durch die Fragmentierung bei der Tandem-MS zu Tage, wenn zum Beispiel der TMT-Kopf davonfliegt und verschieden schwere Schwänze am Peptid verbleiben. Mit TMT kann ein knappes Dutzend Proben markiert werden, die anschließend gemeinsam die Massenspektrometrie durchlaufen. Aus den MS/MS-Daten lässt sich nachverfolgen, welches identifizierte Peptid aus welcher Probe stammt (ein Review zum Thema gibt es hier).
Viren aus Wuhan
Um das mePROD-Verfahren für die Suche nach Wirkstoffen gegen das SARS-2-Virus einsetzen zu können, benötigten die Frankfurter zunächst eine entsprechende Infektionsstrategie. Von Studien mit dem SARS-1-Virus leiteten sie ab, dass Caco-2-Zellen (eine menschliche Darmepithelkrebs-Zelllinie) dem Virus ein passendes Umfeld für Infektion und Vermehrung bieten. Die Gruppe setzte deshalb Caco-2-Zellkulturen an und ließ eine definierte Menge SARS-2-Viren auf diese los, die von positiv getesteten Wuhan-Rückkehrern stammten. Münchs Team legte eine Viruskonzentration fest, die ausreichte, möglichst alle Zellen zu infizieren. Bei einer zu geringen Konzentration wäre die Reaktion der Zellen zu schwach, bei einer zu hohen Konzentration würden Mehrfach-Infektionen eine komplexe, unverständliche Antwort hervorrufen.
Weil vorerst unklar war, zu welchem Zeitpunkt das Virus Spuren im Proteom hinterlässt, untersuchten die Forscher Proben von infizierten Zellkulturen über einen längeren Zeitraum von zwei Stunden bis zu einem Tag. Dazu kultivierten sie die Zellen in einem Medium, das Isotop-markierte Aminosäuren (Arg, Lys; 13C, 15N) enthielt, die in frisch synthetisierte Proteine eingebaut werden. Anschließend schloss das Team die Zellen auf und bereitete die Proteinproben durch Trypsin-Verdau und TMT-Markierung für die Flüssigchromatographie Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.
Chronologie der Virus-Infektion
Die Analyse des Massenspektrums ergab, dass sich das SARS-2-Virus fünf Stunden nach dem Zellkontakt vermehrte und die Replikation nach zehn Stunden auf vollen Touren lief. Erste Spuren im Proteom infizierter Zellen hinterließ das Virus nach sechs Stunden. Nach einem Tag drosselte es den Cholesterin-Stoffwechsel der Zellkulturen stark und drehte gleichzeitig ihren Kohlenhydrat-Stoffwechsel gehörig auf.
Dass unter den verstärkt translatierten Proteinen fünf vom SARS-2-Virus stammten, war keine Überraschung, aber eine große Hilfe. Die Frankfurter konnten so gezielt nach Proteinen der Wirtszellen fahnden, die gemeinsam mit den Virusproteinen translatiert wurden. Unter den 244 Proteinen, die sie fanden, waren Komponenten der Translations-Maschinerie besonders stark vertreten.
Potenzielle Wirkstoff-Waffen
Könnten Translations-Inhibitoren eine potenzielle Waffe gegen das SARS-2-Virus sein? Tatsächlich verhinderten die Translations-Hemmer Cycloheximid und Emetin die Vermehrung des Virus, und zwar bei Konzentrationen, die für die Wirtszellen nicht toxisch waren. Auch den Nukleinsäure-Stoffwechsel scheint das SARS-2-Virus zu manipulieren. Nukleosid-Analoga wie Ribavirin alias Virazole, das die Guanosinnukleotid-Synthese hemmt, sollten den Infektionsverlauf also ebenfalls stoppen. Das tun sie auch – zumindest in dem Zellkultursystem der Frankfurter Forscher.
Inzwischen hat das kanadische Pharmaunternehmen Bausch Health Americas eine klinische Studie mit 50 Probanden gestartet, die die Wirkung von Ribavirin gegen das SARS-2-Virus testet. Zur Hoffnung in Ribavirin trägt auch eine Strukturmodellierungs-Studie bei, die zum Ergebnis kommt, dass der Wirkstoff an die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) des SARS-2-Virus bindet (Life Sci, 253:117592).
Andrea Pitzschke
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Klann K. et al. (2020): Functional translatome proteomics reveal converging and dose-dependent regulation by mTORC1 and eIF2a. Molecular Cell, 77, 913-25
Bojkova D. et al. (2020): Proteomics of SARS-CoV-2 infected host cells reveals therapy targets. Nature, DOI: 10.1038/s41586-020-2332-7