Zellfreie Expressionssysteme schließen Überraschungsfaktoren, die bei Arbeiten mit Zellen unweigerlich auftreten, weitgehend aus. Hochreine Systeme, bei denen die Einzelkomponenten separat exprimiert, gereinigt und dann nach dem Baukastenprinzip zusammengemischt werden, sind aber nicht nur teuer: Aufgrund der minimalen Rekonstitution der Transkriptions-Translations-Maschinerie lassen sich die damit erzielten Ergebnisse auch nur bedingt auf die tatsächliche In-vivo-Situation übertragen.
Ein guter Kompromiss sind zellfreie Systeme, die aus Zelllysaten, etwa von E. coli, hergestellt werden. Aber auch hier muss man ungewünschte Komponenten möglichst vollständig loswerden, wenn diese die Synthese des gewünschten Proteins stören. Dies gilt insbesondere für Proteinsynthesen mit nicht-kanonischen Aminosäuren. Da Aminoacyl-tRNA-Synthetasen kanonische Aminosäuren nicht-kanonischen vorziehen, muss man die Störenfriede entfernen, zu denen insbesondere das allgegenwärtige Lysin zählt. Wie dies sehr einfach geht, zeigen Albrecht Ott und sein Team von der Universität des Saarlands in einem bioRxiv-Paper.
Trick mit Dummy
Der Trick aus Saarbrücken besteht darin, Lysin in die Protein-Attrappe High Lysine Dummy Protein (HLDP) einzubauen und diese anschließend über die Wechselwirkung von Lysin mit DNA zu entfernen. Da die Genexpression durch sich wiederholende Adenine ins Stottern gerät, setzten die Forscher zwischen jedes Lysin-Codon (AAA) das Codon einer beliebigen anderen Aminosäure. Auf den Start (Methionin) folgen 53 von beliebigen Proteinen (X) unterbrochene Lysine, der C-Terminus besteht aus einem His-Tag. In Kurzform lautet die Sequenz des Dummy-Proteins M(XK)53H6.
Um den Lysin-Einbau in das HLDP-Dummy-Protein und dessen Expression verfolgen zu können, verknüpften die Forscher HLDP mit einer Variante des grünfluoreszierenden Proteins (deGFP), die für die zellfreie Expression optimiert ist. Zudem amplifizierten die Saarbrücker die GHLPD-Fusionssequenz mit Biotin-markierten Primern. Mithilfe des Biotins hängten sie das GHLDP-Konstrukt schließlich an Streptavidin-ummantelte Metallkügelchen (Beads). Danach konnten sie mit der Entfernung von Lysin aus E.-coli-Lysaten loslegen.
Alle außer Lysin
Dazu inkubierte die Gruppe die mit GHLDP-DNA beladenen Beads bei 29°C in einem zellfreien Rohextrakt aus E. coli. Zu diesem gaben sie Puffer, PEG sowie alle Aminosäuren außer Lysin in einer Konzentration von jeweils 6 mM zu. Nach einer halben Stunde fingen Otts Mitarbeiter die Beads mit einem Magneten wieder ein und beseitigten hierdurch die für die weitere Prozedur ungewünschte GHLDP-DNA.
Anschließend entfernten sie auch die mRMA-Moleküle aus dem verbliebenen Überstand, die bei der Transkription der Dummy-DNA entstanden waren. Hierzu verwendete die Gruppe Streptavidin-Beads, die auf ihrer Oberfläche einzelsträngige, zum 3‘-Ende der Dummy-Sequenz komplementäre DNA trugen, sowie polyT-Beads, die gegen den polyA-Schwanz von mRNAs gerichtet waren.
Da ssDNA über elektrostatische Wechselwirkungen an Lysin bindet, wurde das Team auf diese Weise auch letzte freie Lysin-Moleküle los. Die an die Beads gebundenen mRNAs sowie Lysin-Moleküle beseitigte die Gruppe schließlich mithilfe eines Magneten.
Mit einem einfachen Test überprüfte Otts Team, ob das Expressionssystem fit und tatsächlich frei von Lysin-Kontaminationen war. Dazu inkubierten die Forscher zwei Aliquots des Überstands mit deGFP-DNA: Einmal mit und einmal ohne zugesetztes Lysin. Nur in den Proben mit zusätzlichem Lysin konnten sie eine Fluoreszenz erkennen.
Die richtige Balance
Beim Timing der einzelnen Schritte ist es wichtig, die richtige Balance zu finden. Durch eine längere Inkubation wird Lysin sowie mRNA zwar gründlicher beseitigt. Die Fitness des Expressionssystems leidet jedoch unter dem zusätzlichen Energieverbrauch. Schließlich dürfen die benötigten Enzyme nicht verschlissen sein, bevor die eigentliche Expression beginnt. Auch die Menge der Kügelchen muss für jede Lysat-Präparation optimiert werden. Sind es zu wenig, wird das Lysin nicht gründlich genug entfernt. Zu viele Streptavidin-Kügelchen wiederum fangen unter Umständen, neben den eigentlichen Zielen, auch andere essenzielle Komponenten des Expressionssystems ein. Zudem können in den Überstand mitgeschleppte Beads die Expression hemmen.
Andrea Pitzschke
Finkler M. et al. (2020): A bead-based method for the removal of the amino acid lysine from cell-free transcription-translation systems. BioRxiv, doi:10.1101/2020.01.15.907360
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