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Totgesagte leben länger

(30.10.2019) Die Effizienz des CRISPR-Cas9-Editings wird meist nur auf Genom-Ebene kontrolliert. Das reicht jedoch nicht immer.
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Ob beim Gen-Knockout (KO) mit CRISPR-Cas9 alles nach Plan gelaufen ist, wird meist nur anhand des Zielgens gecheckt. Aber wie sieht es mit der Expression des Proteins aus, das von diesem Gen codiert wird? Liegt diese tatsäch­lich am Boden? Oder rappelt sich die Zelle doch noch auf und versucht ein Protein zu expri­mieren, das zumin­dest einen Teil seiner ursprüng­lichen Aufgaben erfüllt?

Diese Frage stellte sich ein interna­tionales Forscher­konsortium um Wolfgang Huber und Lars Steinmetz vom Heidel­berger EMBL sowie Gerard Drewes von der Heidel­berger Biotech-Firma Cellzome (die seit 2012 zu Glaxosmithkline gehört). Die Gruppe nahm insbeson­dere CRISPR-Cas9-induzierte Knockouts unter die Lupe, die durch eine Verschie­bung des Lese­rahmens entstehen. Der Cas9-sgRNA-Komplex zielt hierbei auf eine codie­rende Sequenz im Zielgen ab, woraufhin beide DNA-Stränge geschnitten werden. Beim Bestreben der zell­eigenen Reparatur­maschinerie, den Bruch durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) zu reparieren, treten Inser­tionen oder Deletionen auf, die zu Lese­rahmen-Verschie­bungen und vorzeitigen Stopp­codons führen. Die hieraus entstehenden mRNAs haben eigentlich keine Chance translatiert zu werden und werden durch Nonsense-Mediated Decay (NMD) abgebaut.

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Erstaunlicher Fund

Ganz so einfach scheint die Sache aber nicht zu sein. Die Forscher­gruppe induzierte durch CRISPR-Cas9 in 193 isogenen HAP1-Zelllinien einen Frameshift-Knockout in jeweils einem von 136 Zielgenen. Anschlie­ßend schaute sie sich die RNA-Expression dieser Zielgene mithilfe einer RNA-seq in 174 der KO-Zelllinien an und verglich diese mit den ursprüng­lichen Zelllinien. Zu ihrem Erstaunen fand die Gruppe auch in vielen der KO-Zelllinien relevante Mengen mRNA, die von den eigentlich ausge­knockten Zielgenen stammte. Obwohl die mRNAs vorzeitige Stopp­codons enthielten, wurden sie vom NMD offensichtlich nicht erkannt und auch nicht abgebaut.

Ob diese mRNAs auch in Proteine translatiert wurden, untersuchte das interna­tionale Team mit einer Kombi­nation aus Tandem-Mass-Tag-Isobaric-Labelling und Triple-Stage-Massen­spektro­metrie. Tatsäch­lich konnte die Gruppe mit dieser Technik in ungefähr einem Drittel der KO-Zelllinien signifikante Mengen der jeweils ausge­knockten Proteine nachweisen. Interes­san­terweise korrelierten die Protein­mengen nicht mit den Mengen des dazu gehörenden Transkripts. Solange in einer Mutante auch nur ein Hauch mRNA vorhanden war, die von einem eigentlich ausge­knockten Gen stammte, war die entspre­chende Protein­expression noch nicht erledigt.

Expression bleibt

Das ging so weit, dass selbst verkrüppelte Proteine ihre ursprüng­liche Funktion teil­weise erfüllten. Im Fall von BRD4-Mutanten (Bromo­domain-containing protein) fand die Gruppe zum Beispiel über zehn Prozent verbliebene Protein­expression. Den unter­schiedlich langen Brd4-Protein­varianten, die offen­sichtlich durch transla­tionale Re-Initiation an mehreren Methionin-Codons entstanden waren, fehlte jedoch ein N-terminales Stück. Aufgrund der verkürzten Domäne bindet die BRD4-Mutante zwar nicht wie Wildtyp-BRD4 an Histon H4, jedoch an einen Bromo­domänen-Inhibitor.

Noch krasser war der Funktions­erhalt im Fall der DNA-Methyltransferase1 (DNMT1). Während eine 20bp-Deletions-Mutante wirklich defekt ist, wird DNA von einer 5bp-Deletions-Mutante normal methyliert. Ob ein Zielgen nach CRISPR-Cas9 tatsäch­lich ausge­knockt oder nur angezählt ist, weiß man also erst, wenn man auch die Protein­expression untersucht.

Andrea Pitzschke

Smits A. et al. (2019): Biological plasticity rescues target activity in CRISPR knock outs. Nature Methods, DOI: 10.1038/s41592-019-0614-5








Letzte Änderungen: 30.10.2019

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