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Kleiner Alleskönner

(19.06.2019) Ein universeller Epitop-tag, der für sämt­liche Anwendungen gleich gut geeignet ist, wäre ein echter Knüller. Und es gibt ihn tatsächlich.
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Epitop-tags, mit denen man Proteine isolieren oder ihre Lokalisation in der Zelle bestimmen kann, sind so handlich und vielseitig einsetzbar wie ein Schweizer Taschenmesser. Schön wäre es aber, wenn man nicht für jeden Zweck ein anderes Werkzeug des Taschenmessers aufklappen müsste, sondern alles mit einem einzigen tag erledigen könnte. Das war bisher aber nicht möglich: tags, die sich prima für die Reinigung rekombinanter Proteine eignen, wie etwa der His-tag, sind für Immuno-Färbungen nicht zu gebrauchen. Andere tags wie der FLAG-tag, die bei Immuno-Blots funktionieren, sind wiederum zu klobig für die höchstauflösende Mikroskopie.

Ein neuer Epitop-tag, den ein Team um Felipe Opazo und Steffen Frey vom Göttinger Start-up NanoTag Biotechnologies sowie Ralf Jungmann vom MPI für Biochemie in Martinsried und Pal Stenberg von der schwedischen Lund University entwickelte, macht Schluss mit der ständigen Hin-und-Her-Kloniererei verschiedener tags: Der von der Gruppe konstruierte ALFA-tag, samt zugehörigem Nanobody, passt für alle Anwendungen.

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Ein Traum wird wahr

Statt bestehende Epitop-tags zu optimieren, hat das deutsch-schwedische Forscherteam Nägel mit Köpfen gemacht und den ALFA-tag von Grund auf neu gestaltet. Zuallererst galt es jedoch, die gewünschten Charakter-Eigenschaften des Traum-tags zu definieren und diese in eine passende Aminosäure-Sequenz zu übersetzen.

Der ideale tag sollte klein sein und Struktur, Topologie, Lokalisation, Löslichkeit, Aggre­gationsverhalten sowie polares Interaktionsverhalten des dekorierten Proteins möglichst nicht verändern. Dazu sollte er sich quer über das Organismen-Reich gut exprimieren lassen, in der Natur nirgends vorkommen und auch Proteasen und harschen Wasch­bedingungen, etwa bei der Protein-Aufreinigung, widerstehen. Lysin war als Baustein tabu, weil dessen primäre Amingruppe mit Fixierlösungen oder quervernetzenden Substanzen reagiert.

Inspiriert von einer russischen Studie über künstliche Peptide mit stabilen alpha-Helices kreierte die Gruppe schließlich den fünfzehn Aminosäure langen ALFA-tag, der all diese Forderungen erfüllt. Er ist hydrophil und unter physiologischen pH-Bedingungen ungeladen. Seine stabile Alpha-Helix hält selbst widrigen Bedingungen stand und findet immer wieder in ihre Ursprungsfaltung zurück.

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In Säugerzellen getestet

Ein tag ist aber nur so gut wie ein gegen ihn gerichteter Antikörper. Deshalb immunisierte das Team Alpakas mit dem rekombinanten ALFA-Peptid und sortierte die von den Tieren gebildeten anti-ALFA-Nanobodies (NbALFA) mit einer neuen Technik aus. An den nur 122 Aminosäuren langen NbALFA-Nanobody hängten die Forscher anschließend ein rotfluo­reszierendes Fluorophor und testeten das Gespann aus ALFA-tag und NbALFA-Nanobody zunächst in PFA-fixierten Cos-7-Zellen. Die Säugerzellen exprimierten verschiedene Fusions-Proteine mit bekannter Lokalisation: Tom70-EGFP-ALFA (Mitochondrien-Membran), ALFA-Vimentin (Filamentstrukturen) sowie EGFP-ALFA-TM (Plasmamembran).

Alle Proteine wurden von den NbALFA-Nanobodies an den erwarteten Orten in den Zellen detektiert. Dabei spielte es keine Rolle, ob sich der ALFA-tag an den Enden oder zwischen strukturellen Domänen innerhalb des Fusions-Proteins befand. Da er keine Lysin-Reste enthält, wird seine Funktion auch nicht durch die Gewebefixierung mit Paraformaldehyd, Methanol oder zwei-prozentigem Glutaraldehyd gestört. Darüber hinaus ist das System aufgrund der kleinen Größen von ALFA-tag und NbALFA-Nanobody auch für die Nanoskopie beziehungsweise höchstauflösende Mikroskopie bestens geeignet.

Und auch beim Western Blot übertrumpft der neue tag die klassischen Vertreter, etwa HA-, myc- oder FLAG-tag mit einer drei- bis zehnfach höheren Sensitivität – trotz der Signal-Amplifikation bei den üblichen zweistufigen Detektionssystemen. ALFA-tag und Nanobody scheinen tatsächlich ein Traumpaar zu sein, was auch die Kristallstruktur bestätigt. Viele verschiedene Interaktionen helfen beim gegenseitigen Festhalten und bringen Stabilität: Hieran sind fast alle Aminosäurereste des tags beteiligt.

Wirkungsvoll ausgetauscht

Für die Protein-Aufreinigung an Matrixmaterialien, etwa Agarose-Harzen, schien diese enge Beziehung zunächst hinderlich zu sein, da sich das immobilisierte Protein selbst mit rabiaten Pufferrezepturen nicht ablösen ließ. Abhilfe brachte erst der Tausch zweier Aminosäuren im ALFA-tag. Danach ließen sich die Wunschproteine aus E.coli oder HeLa-Zellextrakten isolieren und auch kniffligere Aufgaben wie Co-Immuno-Präzipitationen waren kein Problem mehr.

Es klingt fast zu schön, um wahr zu sein, aber offensichtlich kann man mit dem ALFA-tag sogar Zellen gezielt abfangen, wodurch der Grundstein für die Zelltherapie mit Chimären Antigen-Rezeptoren (CAR-T-Zell-Therapie) gelegt wäre. So gelang es den Forschern zum Beispiel mit dem ALFA-tag CD62L-Lymphozyten aus einem Zellgemisch zu isolieren. Dazu knüpften sie ihn an einen anti-CD62L-Antikörper, der an der Zelloberfläche sitzende CD62L-Epitope erkennt. Die ALFA-anti-CD62L-Fusion fischte die Gruppe schließlich mit einem ALFA-Nanobody heraus, der an einer Matrix immobilisiert war.

Andrea Pitzschke

Götzke H. et al. (2019): A rationally designed and highly versatile epitope tag for nanobody-based purification, detection and manipulation of proteins. BioRxiv, DOI: 10.1101/640771



Letzte Änderungen: 19.06.2019

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