Um die Menge eines Zielproteins mit einem Western Blot bestimmen zu können, misst man die Signal-Intensität der Proteinbanden. Akkumuliert das anvisierte Protein vielleicht in einem bestimmten Gewebe oder nach einem bestimmten Reiz? Lässt es sich mit der neuesten Puffer-Rezeptur mit besonders guter Ausbeute extrahieren? Antworten auf diese Fragen erhält man nur, wenn man weiß, wie viel Gesamtprotein ursprünglich auf das Gel geladen wurde.
Mit einfachen Protein-Quantifizierungsmethoden, wie zum Beispiel dem Bradford-Assay, kann man mehrere Proben auf eine einheitliche Konzentration einstellen, um halbwegs identische Mengen aufzutragen. Doch für den endgültigen Beleg, dass auf dem Polyacrylamid-Gel in jeder Spur wirklich gleiche Proteinmengen geladen wurden und der Transfer auf die Nitrozellulose (NC)- oder PVDF-Membran für alle Spuren gleich effizient war, kann nur die Blot-Membran selber liefern.
Normalisierung heißt das Zauberwort, und hier scheiden sich die Geister. Die einen setzen auf „Housekeeping-Proteine“, die in allen Geweben – vermeintlich – gleichstark exprimiert werden, und mithilfe eines entsprechenden Antikörpers, zusätzlich zum eigentlichen Zielprotein, auf derselben Membran detektiert werden. Wenn die Banden auf unterschiedlicher Höhe laufen geht dies auf dem gleichen Blot. Ansonsten muss man den Blot „strippen“ nachdem das Zielprotein detektiert wurde und erneut mit dem Antikörper gegen das Housekeeping-Protein inkubieren.
Das Problem dabei ist, dass Housekeeping-Proteine, wie zum Beispiel b-Aktin oder GAPDH, je nach Zelltyp und Stimulus variieren können. Außerdem werden sie meist so stark exprimiert, dass die detektierten Signale häufig außerhalb des linearen dynamischen Bereichs liegen. Auch das „Strippen“ der Membran ist nicht unproblematisch, da nicht immer alle Antikörper gleich gut von der Membran entfernt werden.
Für die Normalisierung kann man aber auch einen Farbstoff verwenden, der an die Membran-gebundenen Proteine bindet und sich wieder ablösen lässt. Meist wird hierzu der rosarote Diazo-Farbstoff Ponceau S verwendet, dessen negativ geladene Gruppen an positiv geladene Aminosäure-Reste binden. Ein Team um Aldrin Gomes von der University of California, Davis hat sich systematisch durch Publikationen, Firmen- und andere Webseiten gewühlt, um herauszufinden, welches der zahllosen Ponceau S-Färbe-Protokolle das beste Ergebnis liefert.
Die Mitarbeiter von Gomes stellten Proteinextrakte aus Rattenleber her und setzten sie für verschiedene Ponceau S-Färbemethoden ein. Dazu luden sie vier beziehungsweise zehn Mikrogramm Protein auf ein Gel und transferierten die Proteine danach auf Nitrocellulose-Membranen. Die Blots färbte die Gruppe mit einer Ponceau S-Rezeptur, fotografierte sie und entfärbte sie schließlich in PBS. Anschließend färbte die Gruppe dieselben Blots nochmals mit einer kommerziellen Lösung zur Proteindetektion (Amresco PoncauS, Geheimrezeptur).
Die Ergebnisse des Färbemarathons sind ganz interessant. So spielt zum Beispiel die Inkubationszeit offensichtlich bei der Färbung keine Rolle: nach einer Minute ist die Farbe genauso intensiv wie nach fünf oder zehn Minuten. Die meist empfohlene Inkubationsdauer von fünf Minuten kann man also bedenkenlos abkürzen. Es ist auch völlig egal, in welcher Säure der Farbstoff gelöst ist, und welche Konzentration er hat. Mit 0,01 % Ponceau S in 0,1-prozentiger Essigsäure erzielt man die gleiche Sensitivität wie mit 2 % Ponceau S in 30-prozentiger Sulfosalicylsäure. Nur ist letztere viel teurer und giftiger. Die meisten kommerziellen Ponceau S-Lösungen enthalten 0,1 % Ponceau S – mit 0,001 % erhielten die Autoren jedoch bereits genauso zufriedenstellende Resulate. Den Kollegen empfehlen sie dennoch, den Farbstoff sicherheitshalber auf 0,01 % zu konzentrieren
Die Forscher luden sechs BSA-Proben mit verschiedenen Proteinmengen (75, 125, 250, 500, 1000, 2000 ng) auf die Gele und tasteten sich so an die Detektionsschwelle der Färbemethode heran. Diese liegt bei 125 Nanogramm.
Die kalifornische Gruppe empfiehlt daher für die Ponceau S-Färbung zur Normalisierung von Western Blot-Signalen 0,01 % Ponceau S in 1 % Essigsäure sowie eine Inkubationsdauer von zwei Minuten. Alles andere ist Zeit- und Material-Verschwendung.
Andrea Pitzschke
Sander H. et al. (2019): Ponceau S waste: Ponceau S staining for total protein normalization. Analytical Biochemistry, 575:44-53