Die synthetische Organelle in Zellen: Nuklei (grün), Ribosomen (cyan), Microtubuli (gelb) und die orthogonale tRNA-Synthetase (magenta).
Mit den zwanzig kanonischen Aminosäuren synthetisieren Zellen die vielfältigsten Proteine. Welcher Baustein wo eingebaut wir, gibt die Codon-Abfolge der entsprechenden mRNA vor: Jedes Codon hat sein passendes Pendant aus tRNA/tRNA-Synthetase, das sequenzspezifisch andockt, die mitgebrachte Aminosäure ablädt und so die wachsende Peptidkette um eine Aminosäure verlängert.
Funktioniert man eine tRNA-Synthetase so um, dass sie anstelle einer normalen Aminosäure eine nicht-kanonische Aminosäure (ncAA) schultert, kann man Peptidketten mit speziellen Eigenschaften herstellen, etwa mit einer Fluoreszenzfunktion. Die zelleigene Translations-Maschinerie inklusive der Ribosomen behandelt das eingeschleuste ncAA-Kuckucksei wie eine proteinogene Aminosäure und baut es in die wachsende Peptidkette ein.
Meist verwendet man das zumindest in E. coli selten vorkommende Amber-Stopcodon (TAG), um die ncAA mithilfe eines entsprechenden tRNA/tRNA-Synthetase-Paares anstelle des Translations-Endes in die Peptidsequenz einzubauen. Als sogenanntes orthogonales tRNA/RNA-Synthetase (RS)-System wird hierzu häufig die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase (PylRS) und die entsprechende tRNA Pyl aus dem Archaeon Methanosarcina mazei eingesetzt.
Das PylRS/tRNA Pyl-System funktioniert grundsätzlich in verschiedenen Organismen, die von E.coli bis zu lebenden Mäusen reichen. Aber es gibt ein Problem: Setzt man es im Zytosol ein, so wird die ncAA nicht nur an den Stopcodon-Positionen des gewünschten Proteins eingebaut, sondern auch an Stopcodon-Positionen anderer Proteine.
Die Gruppe um Edward Lemke vom Institut für Molekulare Biologie in Mainz hat sich daher eine Strategie ausgedacht, mit der man die gewünschten mRNA-Spezies sowie die ncAA-tragende Suppressor-tRNA-Synthetase gezielt in eine eigene Kuschelzone innerhalb der Zelle locken kann. Ein von einer Membran umgebenes Kompartiment wäre hierfür ungeeignet, weil die Membran der Translations-Maschinerie den Zutritt ins Innere verwehren würde. Lemkes Gruppe kam deshalb auf die Idee, in den Zellen eine membranfreie Organelle herzustellen, in die nur Moleküle gelangen, die für die Translation einer gewünschten mRNA nötig sind.
Für die Konstruktion der membranfreien Organelle verwendete die Gruppe Proteinfusionen mit sogenannten Assemblern. Als Assembler kamen entweder Proteine in Frage, die sich in zwei Phasen auftrennen, oder aber Kinesine, die sich in bestimmten Zellarealen anreichern. Zu den Phasen-getrennten Proteinen zählt das Spindle Defective Protein (SPD5) aus C. elegans. Der größte Teil der SPD5-Moleküle kondensiert zu Tröpfchen, die sich lokal in der Zelle konzentrieren während die lösliche Fraktion im Zytosol verteilt ist. Im Fall von Kinesin dirigiert eine gekürzte Version Fusionsproteine zum Plus-Ende von Mikrotubuli und bewirkt so ebenfalls eine lokale, räumliche Konzentration.
Um mit der Assembler-Strategie ncAA in wachsende Peptidketten einbauen zu können, brachten die Mainzer in der ausgewählten mRNA sogenannte ms2-Loops unter, die der mRNA-Bindedomäne des Major Capsid Proteins (MCP) als Andockstelle dienten. Damit die ms2-Loops nicht translatiert wurden, lagen sie in der 3‘-Untranslatierten Region (UTR). Mittendrin in der mRNA-Sequenz saß dagegen das Stopcodon für den Einbau der ncAA.
Das MC-Protein fusionierte die Gruppe mit einem Assembler-Protein, das die gebundene mRNA in Tröpfchen (SPD5-Assembler) oder am Ende der Mikrotubuli (Kinesin-Assembler) konzentrierte. Auch die ncAA-beladene tRNA-Synthetase verband das Team mit einer Assembler-Domäne, wodurch es sich ebenfalls in den membranfreien Organellen anreicherte. Die unbehandelte mRNA schwamm dagegen frei im Zytosol herum. Entsprechend gering war ihre Chance, einer manipulierten tRNA-Synthetase zu begegnen.
Lemkes Gruppe testete verschiedene potenzielle Assembler auf ihr Vermögen, Fusionsproteine lokal anzureichern. Als optimal erwies sich eine Kombination aus Phasentrennung und Kinesin-vermittelter Sortierung. Das anzureichernde Protein (MCP sowie tRNA-Synthetase) trägt dann je eine Domäne beider Assembler-Typen. Mit dieser Strategie entstehen im Zytosol der Zellen Organellen-artige Strukturen mit einer Größe von mehreren Mikrometern.
Damit hatten die Mainzer mRNA sowie das tRNA/tRNA-Synthetase-Paar schon einmal wunschgemäß sortiert. Für eine erfolgreiche Translation fehlten aber noch die Ribosomen. Die lassen sich nicht so einfach mit einer Assembler-Domäne dirigieren, was aber offenbar nichts ausmacht. Immunfluoreszenz-Experimente zur ribosomalen Markierung zeigten nämlich, dass die Ribosomen zwar querbeet im Zytosol verteilt waren, einige aber auch in den membranfreien Organellen landeten. Vermutlich wurden sie teilweise von mRNAs mit ms2-Loops dorthin geschleppt.
Die membranfreien Organellen eröffnen weitere interessante Möglichkeiten bei der Expansion des genetischen Codes. So könnte man mit ihnen auch die zwei weiteren Stopcodons Opal und Ocker in Eukaryonten unterdrücken, oder aber Proteine in vivo herstellen, die an festgelegten Positionen unterschiedliche ncAAs tragen.
Andrea Pitzschke
Reinkemeier C. et al. (2019): Designer membraneless organelles enable codon reassignment of selected mRNAs in eukaryotes. Science, DOI: 10.1126/science.aaw2644