Klonieren ist Hirn- und Handarbeit. Wer in Ersteres investiert, kann an Letzterem sparen. Aber selbst bei einem gut durchdachten Klonierungskonzept muss man die positiven Klone unter hunderten fehlerhaften herauspicken. Sobald ein Klon das Resistenzgen trägt, wird er wachsen, da kann das Konstrukt noch so verquer sein. Statt immer nur nach der Nadel im Heuhaufen suchen zu müssen, wäre es wesentlich geschickter, wenn falsche Klone, etwa mit religiertem Insert-freien Vektor, gar nicht erst auftauchen würden. Mit der Zero-Background Redα- oder kurz ZeBRα-Klonierungsstrategie, die Stefan Schusters Team von der Uni Bayreuth entwickelte, wird dieser Wunsch erfüllt.
Schusters Gruppe konstruierte hierzu einen Vektor mit eingebauter „Selbstmord-Kassette“. Nur wenn diese rausgeschmissen und durch ein oder mehrere gewünschte Inserts ersetzt wird, überlebt das transformierte Bakterium. Die Selbstmord-Kassette enthält das ccdB-Gen, dessen Produkt die lebensnotwendige Gyrase lahmlegt. Ein schöner Nebeneffekt des ZeBRα-Prinzips ist, dass man sich die Gel-Aufreinigung des geöffneten Vektors sparen kann. Selbst wenn unter den linearisierten Vektoren ein paar nicht-geschnittene mit dabei sind, erzeugen sie keinen Hintergrund aus falsch-positiven Klonen. Bei einer Antibiotika-Resistenzkassette würde diese Schlampigkeit mit einem fetten Bakterienrasen bestraft werden.
Ziel der Bayreuther war es, eine einfache, kostengünstige und universell anwendbare Klonierungsmethode zu etablieren, die sich nicht auf bestimmte Vektorsysteme beschränkt und bei der man nicht mühsam kompatible Restriktionsenzym-Motive aufspüren und kombinieren muss. Auch die gleichzeitige Ligation mehrerer Inserts sollte möglich sein, und das natürlich fehlerfrei. Das Ganze ohne Kits sowie teure Zutaten und auch noch möglichst schnell. Wie geht das?
Die Gruppe orientierte sich an der Seamless Ligation Cloning Extract-Technik (SlicE). Bei dieser verwendet man einen bakteriellen Zellextrakt als billige Quelle für die Enzymaktivitäten, die nötig sind, um mehrere Inserts durch die Rekombination homologer Enden mit mehr als 15 Basenpaaren aneinander zu ketten (Nucleic Acids Res, 40(8): e55). Die Enden werden hierzu mit einer simplen PCR-Amplifikation an die Wunsch-DNA angehängt.
Schusters Team machte sich aber zunächst an die Optimierung des benötigten E. coli-Extrakts, der RedA-Exonuklease sowie die Proteine Bet und Gam als Werkzeuge für die homologe Rekombination enthält. Der dafür verwendete E. coli-Stamm PPY trägt diese Gene bereits in seinem Genom. Im ursprünglichen SliCE-Verfahren ist die Gewinnung des Extrakts ziemlich aufwendig und benötigt Fingerspitzengefühl, da man den richtigen Zeitpunkt für die (Arabinose-gesteuerte) Induktion erwischen muss. Die Bayreuther Gruppe kürzte die Prozedur mithilfe eines Arabinose-Autoinduktions-Mediums deutlich ab. Die Zusammensetzung des Mediums ist so mit dem Zuckerstoffwechsel der Bakterien abgestimmt, dass Zellen ganz von selbst den passenden Zeitpunkt und die Intensität der Expression bestimmen.
Außerdem prüfte Schusters Mannschaft die gängigen nicht-ionischen Detergenzien CHAPS, SB-12, OTG, OG und DDM auf ihre Qualitäten beim Zellaufschluss. Da Detergenzien die verwendeten Zellen schädigen oder Nukleasen und Proteasen ungewollt scharf machen können, wurden die Extrakte nach der Lyse über Silika-Säulchen gereinigt. Dieser Schritt scheint tatsächlich essentiell zu sein und erhöhte die Transformationseffizienz erheblich.
Autoinduzierte PPY-Extrakte, die mit OTG aufgeschlossen und über Säulchen gereinigt wurden, lieferten die besten Ergebnisse. Selbst mit hausgemachten chemisch-kompetenten Zellen (NEB 5-alpha) erhielt die Gruppe rekombinante Klone, welche die gewünschten Konstrukte trugen. Bis zu fünf Inserts versuchten die Forscher in einem Aufwasch in den Vektor zu ligieren. Natürlich sank die Ausbeute an Rekombinanten mit der Anzahl der Inserts. Mit vier Inserts waren es zum Beispiel etwa sechsmal weniger als mit drei. Wichtiger ist jedoch, dass die Gruppe Rekombinanten erhielt, die das gewünschte Konstrukt trugen, denn für die erfolgreiche Klonierung genügt ein einziger intakter Kandidat.
Anhand eines grünfluoreszierenden Reporterproteins wiesen die Forscher nach, dass die gewachsenen Kolonien ihr Wunschkonstrukt enthielten. Anders als bei der Kanamycin-Selektion oder anderen Selektions-Verfahren tauchte kein Hintergrundrasen aus falsch positiven Klonen auf.
Praktisch ist auch, dass sich die gereinigten Extrakte portioniert lagern lassen. Mehr als eine Portion auftauen und für dreißig Minuten mit geöffnetem Vektor und den gewünschten DNA-Fragmenten (mit homologen 15bp-Enden) zu inkubieren ist nicht nötig. Vermutlich hilft die im Extrakt anwesende Ligase bei der Rekombination mit.
Schusters Team sieht zwei wesentliche Verwendungszwecke für den ZeBRα-Klonierungs-Vektor. Zum einen könnte er zum Beispiel TOPO-TA-Klonierungsvektoren ersetzen, die für Sequenzierungen oder In-vitro-Transkriptionen eingesetzt werden. Zum anderen kann er als Lieferant für die Selbstmord-Kassette (ccdB) dienen, die sich mithilfe von HindIII-Schnittstellen in beliebige andere Vektoren transferieren lässt.
Andrea Pitzschke
Richter D. et al. (2019): ZeBRα a universal, multi-fragment DNA-assembly-system with minimal hands-on time requirement. Scientific Reports, 9:2980