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Zweifarbige Proteindetektion

(09.01.2019) Kristallviolett wird meist für die Gram­färbung von Bakterien eingesetzt, ist aber auch eine Alternative zur Coomassie-Färbung von Proteinen in SDS-PAGE-Gelen.
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Seit über einem halben Jahrhundert macht Coomassie-Brillant-Blau (CBB) das Rennen, wenn es um die Anfärbung von Protein­proben in SDS-PAGE-Gelen geht. Unkom­pliziert, kostengünstig, geräte­technisch anspruchslos (mehr als ein Schüttler und wiederverwendbare Färbeschälchen sind nicht nötig) – damit lässt CBB alternative Färbemethoden blass aussehen.

Die Protein-Färbung mit CBB basiert auf der Bindung negativ geladener Sulfonsäure-Gruppen an positiv geladene Aminosäurereste. Ein paar Wasserstoffbrücken-Bindungen und van-der-Waals-Kräfte spielen ebenfalls eine Rolle. Bei der gängigen Coomassie-Variante CBB R250 liegt das Detektions-Limit bei zehn bis hundert Nanogramm. Der ebenfalls sehr beliebte Farbstoff CBB G250 funktioniert ganz ähnlich, erreicht aber dank der Bildung kolloidaler Komplexe und dadurch weniger frei­schwimmender Farbmoleküle eine höhere Sensitivität von acht bis zehn Nanogramm.

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Färbelösung made in Südafrika

Kristallviolett (KV), das bisher vornehmlich aus der Färbung Gram-positiver Bakterien (Peptidoglykane) sowie DNA bekannt ist, funktioniert genau anders herum. Als katio­nisches Molekül bindet es an negativ geladene Aminosäuren und müsste sich daher auch zur Proteinfärbung eignen – dachte sich der südafrikanische Malaria-Forscher Dean Goldring von der University of KwaZulu-Natal in Pietermaritzburg, Südafrika und entwickelte mit zwei seiner Mitarbeiter eine neue KV-Färbelösung für SDS-PAGE-Gele und Zymogramme.

Das Forschertrio inkubierte SDS-PAGE Gele, die mit Proben aus E.coli-Lysaten beladen waren, nach der Elektrophorese mit einer Lösung aus 0,001% Kristallviolett in 10% Methanol und 1,5% Essigsäure. Nach dreißig Minuten tauchten gut sichtbare Protein­banden auf, nach etwa zwei Stunden zeichneten sie sich vor einem sauberen und klaren Gel-Hintergrund ab. Erhitzte die Gruppe die Lösung auf 60°C, reichten bereits dreißig Minuten für eine anständige Färbung aus. Auf die bei CBB übliche Entfärbung kann man getrost verzichten – dank der wesentlich geringeren Farbdosierung (0,001% KV statt 0.1% CBB) ist sie nicht nötig.

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Sensitive Kombination

Der wahre Vorteil der KV-Färbung ist aber die Sensitivität. Mit der KV-Lösung allein lassen sich sechzehn Nanogramm Protein nachweisen. Kombiniert man KV und CBB-Färbung, indem man die Färbung in einer Mixtur aus 0,001 % KV und 0,001% CBB, gelöst in 50% Methanol und 1,5% Essigsäure durchführt, lassen sich bereits zwei Nanogramm sichtbar machen.

Kristallviolett ist auch für Western Blots interessant. Anders als CBB, das den Protein­transfer gewaltig stört, beeinträchtigt KV die Wanderung der Proteine auf die Blotmembran nur marginal. Netter Nebeneffekt: Größenstandards (protein ladder) müssen nicht die teureren prestained Varianten sein. Wenn man will, kann man das Gel vor dem Transfer entfärben oder man entfärbt die Membran.

Zumindest für die Peroxidase/Luminol-basierte Detektion auf Nitrozellulose-Blots ist die KV-Färbehistorie kein Problem. PVDF haben die Forscher leider nicht getestet, ebenso­wenig wie alternative Detektionsmethoden. Bleibt also das Risiko, dass sich KV, etwa bei Infrarot-/Fluoreszenz-markierten Antikörpern, doch noch als Spielverderber erweist.

Einen direkten Beleg dafür, dass die Banden auf KV-gefärbten SDS-Gelen tatsächlich von Proteinen und nicht von DNA stammen, liefert das Trio zwar nicht. Goldrings Team geht jedoch davon aus, dass KV in SDS-Gelen keine DNA anfärbt. Der Grund hierfür ist der unterschiedliche pH-Wert von Agarose und SDS-PAGE-Gelen. In Agarose-Gelen, die für die Trennung von DNA verwendet werden, liegt er bei pH 8. In der von der Gruppe verwendeten KV-Färbelösung für SDS-PAGE-Gele dagegen bei pH 2,7.

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Praktische Proteasen-Detektion

Die KV-Färbung ist auch praktisch für die Detektion von Proteasen mit Zymogrammen. Das Team belud nicht-reduzierende SDS-Gele, die Gelatine enthielten, mit Trypsin-Proben sowie einem Größenstandard. Nach der Elektrophorese färbte es die Gele zunächst mit einer Lösung mit geringer KV-Konzentration (0,00025%). Die hieraus resultierenden Banden lieferten den Größenstandard, den die Gruppe in einem Foto festhielt. Anschlie­ßend färbte sie das Gel in einer konzentrierteren KV-Lösung (0,01%), um die proteo­lytischen Spaltprodukte sichtbar zu machen, deren Größe sie mit mithilfe des Standards ermittelte.

Die KV-Färbung hat als sensitivere Alternative zur CBB-Färbung durchaus ihren Reiz. Solange man Proteinextrakte direkt miteinander vergleicht, lassen sich mit ihr qualitative und quantitative Aussagen treffen. Vorsicht ist aber geboten, wenn man Proteinmuster von KV- und CBB-gefärbten Gelen, etwa aus dem eigenen Laborbuch oder in Publikationen, gegenüberstellt. Einzelne Banden, die in KV-gefärbten Gelen der Gruppe auftauchten, fehlten in CBB-R250-gefärbten Gelen. Die Ursache hierfür könnte das gegensätzliche Bindungsprinzip der beiden Farbstoffe sein.

Andrea Pitzschke

Krause R. et al. (2018): Crystal violet stains proteins in SDS-PAGE gels and zymograms. Analytical Biochemistry, 566:107-15

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Letzte Änderungen: 09.01.2019

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