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Drei auf einen Schlag

(05.12.2018) Protokolle für die gemeinsame Reinigung von RNA, DNA und Proteine sind sehr umständlich. Dabei ist die Sache eigentlich ziemlich simpel.
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DNA, RNA und Proteine aus ein und derselben Probe zu isolieren, ergibt Sinn. Einerseits um Probenmaterial einzusparen, andererseits um die Zusammenhänge zwischen Genom, Transkriptom und Proteom im selben Probenmaterial unter­suchen zu können.

Guanidin-Isothiocyanat-basierte Protokolle zur gleichzeitigen Extraktion von DNA, RNA und Proteinen erfordern jedoch mehrere Fällungen und Lösungsschritte. Viel zu umständlich und zeitaufwändig, dachte sich das Team des Molekularbiologen Ying Wang von der Mississippi State University (USA). Ihre Lösung: Man muss die für die Extraktion von RNA, DNA und Proteine verwendeten Kits nur geschickt miteinander kombinieren.

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Durchfluss-Recycling

Extrahiert man im ersten Schritt die RNA mit einer RNA-Extraktionssäule oder mit magne­tischen Beads, bleiben die Proteine im Durchfluss oder im Überstand gelöst, während die RNA an die Säule beziehungsweise die magnetischen Beads bindet. Warum also nicht Durchfluss oder Überstand wiederverwenden, um daraus die Proteine zu gewinnen? Ob und wie gut das funktioniert, testete Wangs Team mithilfe transgener Nicotiana bent­hamiana-Pflanzen, die das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) konstitutiv exprimierten.

Für die Extraktion der Proteine aus Durchfluss oder Überstand wählte die Gruppe einen Spin-Säulen-Kit, bei dem die Proteine in Gegenwart von DMSO an das Säulenharz binden. Die isolierten Proteine wies die Gruppe mit einer Gel-Elektrophorese nach. Zur Kontrolle isolierten die Forscher die Proteine zusätzlich direkt aus dem Ausgangsmaterial mit einem Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA)-Puffer. Hier fiel die Ausbeute zwar etwas höher aus. Die Gruppe konnte jedoch auch mit ihrer eigenen Methode fast alle Banden und auch das Bandenmuster reproduzieren, das sie mit der RIPA-Extraktion erhielt.

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Auch ohne DMSO

Interessanterweise waren die GFP-Signale stärker, wenn Wangs Mitarbeiter die Proteine aus dem Überstand der RNA-Extraktion extrahierten und nicht direkt aus dem Zellextrakt mit dem RIPA-Puffer. Offensichtlich werden durch den Protein-Extraktions-Kit auch stö­rende Substanzen entfernt. Die Protein-Reinigung funktionierte sogar ohne die Zugabe von DMSO. Dies dürfte daran liegen, dass im Überstand der RNA-Extraktion bereits eine hohe Konzentration an denaturierendem Ethanol vorhanden ist.

Die Forscher spekulierten darauf, dass die Zellreste aus dem Zellaufschluss für die RNA-Extraktion auch noch eine ausreichende Menge genomischer DNA enthalten müssten. Für die DNA-Extraktion verwendeten sie ein kommerzielles DNA-Extraktions-Reagenz (DNAzol). Auch in diesem Fall bestätigte sich ihre Vermutung, wenngleich sie im Vergleich zur direkten DNAzol-Extraktion eine fünf bis siebenfach geringere DNA-Ausbeute erhielten – mit 150 bis 200 Nanogramm war diese aber noch allemal ausreichend für weitere Analysen.

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Extraktion aus Kleinstmengen

Die Frage war jedoch, ob die Co-Extraktions-Methode auch mit kleinen Probenmengen funktioniert. Um dies herauszufinden, transferierten Wangs Mitarbeiter mithilfe des Kar­toffelspindelknollen-Viroids (PSTVd) ein GFP-Reporterplasmid in A. thaliana-Protoplasten. PSTVd repliziert sich in A. thaliana, kann die Zellen aber nicht infizieren. Die Gruppe extrahierte anschließend RNA mit der Co-Extraktions-Methode aus 2x10 5 Protoplasten-Zellen und konnte in diesen die PSTVd-Replikation mit RNA-Gel-Blots nachweisen. Auch die Proteinreinigung mit der neuen Methode verlief erfolgreich – Immunoblots belegen die Expression des GFPs in den Protoplasten. Und zu guter Letzt gelang es dem Team, nach der DNA-Extraktion auch noch einen endogenen Transkrip­tionsfaktor zu amplifizieren.

Miriam Colindres

Jiang J. et al. (2018): A simple method to co-purify genomic DNA, RNA, and proteins for functional studies. BioRxiv, November 11, 2018, DOI: 10.1101/467928



Letzte Änderungen: 05.12.2018

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