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Sauber separieren

(12.09.2018) Die Extraktion von Pflanzen-DNA wird häufig durch zähe Zellwände und störende Zellbestandteile erschwert. Effektiv, schnell und günstig geht‘s mit einem neuen Protokoll.
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Pipetten­spitzen kommen direkt mit Ihren Proben in Kontakt. Rein­heit und Quali­tät sind wichtig für die Effi­zienz und Sicher­heit Ihrer Ana­lysen mehr

Moderne Sequenzier-Methoden kitzeln genetische Information aus immer kleineren Proben in immer kürzerer Zeit heraus. Das hilft Onkologen und Obstbauern gleicher­maßen. Letztlich beruhen Krankheiten oder außergewöhnliche Fruchtgröße meist nur auf wenigen genetischen Eigenschaften. Seit Aufkommen der Genotyping-by-Sequencing (GBS)-Technologie ist die Suche nach SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) erheblich schneller und günstiger. Das macht auch die lange vernachlässigten „Orphan Crops“ wieder zu interessanten Forschungsobjekten.

Aber so toll aktuelle Sequenzier-Methoden auch sind, gute Daten kommen dabei nur heraus, wenn die Qualität der extrahierten DNA stimmt. Eine sündteure Küchenmaschine kann aus vergammelten Kirschen schließlich auch kein köstliches Kompott zaubern. Das Verlesen der Proben von Hand ist wiederum zu aufwändig. Für GBS ist saubere DNA, die sich problemlos mit Restriktionsenzymen zerlegen lässt, unerlässlich.

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Ohne organische Lösungsmittel

Ein Team um den Pflanzenforscher Andrew Griffiths vom AgResearch-Institut in Hamilton, Neuseeland, hat eine Methode zur Extraktion genomischer Pflanzen-DNA entwickelt, die ohne organische Lösungsmittel auskommt und 2 mal 96 Proben in drei Stunden schafft. Sie liefert intakte, hochmolekulare DNA aus verschiedensten Pflanzen.

Die Neuseeländer testeten ihre Methode an allem, was ihre Gärten und Felder so hergaben, unter anderem an Reis, Apfel, Roggen und Weiß-Klee, dessen DNA schwierig zu extrahieren ist. Dass das Pflanzenmaterial sowohl frisch als auch konserviert (cryo-getrocknet oder mit Silikakügelchen getrocknet) sein darf, erspart Hektik bei der Ernte. Die neue Extraktionsmethode spart aber auch ordentlich Geld: Die Kosten liegen bei 0,62 US-Dollar je Probe anstelle von sechs bis neun US-Dollar mit kommerziellen Extraktionskits.

Aufregende, exotische Komponenten? Fehlanzeige. Benötigt werden Homogenisie­rungspuffer (NaCl, Tris pH7.4, EDTA, Natriumsulfit, SDS), Präzipitationspuffer (Kaliumazetat, Essigsäure), Bindepuffer (Guanidinchlorid, Tris, EDTA, Ethanol) sowie Waschpuffer (NaCl, Tris pH8, EtOH). Dazu kommen noch diverse 96-Well-Platten, 4 Millimeter Edelstahlkügelchen, eine Kugelmühle und eine Zentrifuge.

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Mit Kügelchen beschossen

Dann kann‘s losgehen: Die 1 ml Rundboden-Wells einer Deep-Well-Platte werden mit je 50 mg Pflanzenmaterial und zwei Edelstahlkügelchen gefüllt. Nachdem man die Platte mit einem Thermal Bond Seal verschweißt hat, lässt man sie fünf Minuten auf flüssigem Stickstoff schwimmen. Anschließend wird sie mit einem Adapter in der auf 30 Hz eingestellten Kugelmühle fixiert. Eine Minute später haben die in den Wells umher schießenden Stahlkügelchen die Proben zu grünem Pulver zerlegt.

Im Eisbad darf die Probenplatte nun langsam auf 0°C akklimatisieren. Kurz zentrifugieren, Deckel ab und Homogenisierungspuffer inklusive Proteinase-K zugeben und sanft vermischen. Durch Zentrifugation entledigt man sich Fasern und anderer grober Störfaktoren. Einen Teil des Überstands transferiert man in eine frische Platte. Die Gruppe hält nichts von dem sonst üblichen Inkubieren und rät dazu, nach der Zugabe des Homogenisierungspuffers zügig weiter zu arbeiten. Eine längere Inkubation führt zu DNA-Abbau und verstopften Silika-Filtern im Extraktionsschritt des Protokolls.

Der in die frische Platte transferierte Überstand wird eins-zu-eins mit Präzipitationspuffer versetzt. Nach fünfzehnminütiger Inkubation und halbstündiger Zentrifugation ist die Probe sauber genug für die eigentliche DNA-Isolation, die nach dem „Platte-in-Platte-Schema“ abläuft. Dazu wird eine 96-Well-Platte mit DNA-bindenden Filtern auf einer normalen Deep-Well-Platte platziert. Die Wells der Extraktionsplatte werden mit 600 µl Bindepuffer äquilibriert und anschließend mit 400 µl des Überstands beladen. Die anschließenden Zentrifugations-, Wasch-Schritte sowie die Elution folgen dem üblichen Standardprogramm der DNA-Extraktion mit Spin-Säulchen.

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Frisch oder getrocknet

Für die Aufarbeitung frischen oder getrockneten Materials gibt es keine sonderlichen Unterschiede. Man kann die Proben auch direkt in die 96-Well-Platte ernten, in Gegenwart von Silikagel trocknen lassen und bis zur eigentlichen Extraktion im Kühlschrank platzsparend gestapelt lagern.

Die Neuseeländer geben noch einige Tipps, wie das DNA-Extraktions-Verfahren noch effektiver beziehungsweise kostengünstiger wird. Die Filterplatte lässt sich durch Wiederbeladen mit einem weiteren Aliquot der gleichen Probe mehrmals verwenden, um die Ausbeute zu erhöhen. Nicht jeder hat genau 96 Proben. Eine halb benutzte Platte wegzuschmeißen oder zu zerschnippeln wäre dumm beziehungsweise schwierig. Wer sauber arbeitet, kann die noch ungenutzten, gekennzeichneten Positionen beim nächsten Mal verwenden. Sollten ein oder zwei Proben mal schiefgehen, kann man die Extraktion im Tube-Format nachholen.

Je nach Spezies schwankte die Ausbeute bei den Extraktionsversuchen der Gruppe zwischen 1 bis 13 µg pro 50 mg Frisch- oder 15 mg Trockenmaterial. Sie war über die Platten-Wells hinweg gleich hoch, das Absorptionsverhältnis A 260/280 nm lag bei 2.0. Auch die von Griffiths‘ Team präsentierte hochmolekulare, saubere DNA-Bande im Agarosegel überzeugt. Insbesondere mit Blick auf den Parallelvergleich mit (schmierigen) DNA-Proben, die mit CTAB-Puffer isoliert wurden. Keine Abstriche gab es bei der Qualität, der mit der isolierten DNA erhaltenen Sequenzen, die bis zum Ende hin sauber gelesen wurden.

Andrea Pitzschke

Anderson C. et al. (2018): Protocol: a versatile, inexpensive, high-throughput plant genomic DNA extraction method suitable for genotyping-by-sequencing. Plant Methods, 2018 14:75



Letzte Änderungen: 12.09.2018

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