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Vielseitige Werkzeugkiste

(27.06.2018) Nanobodys sind klein, wendig und binden sehr spezifisch an ihre Zielproteine. Mit entsprechenden Anhängseln versehen, kann man mit ihnen auch den retrograden Proteintransport untersuchen.
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Zellmembranen werden kontinuierlich auf- und abgebaut, nur so bleiben Zellen im Gleichgewicht. Proteine werden hierzu an die Zelloberfläche verschickt und treten zu gegebener Zeit über den retrograden Transport wieder den Rückweg an.

Der retrograde Transport von Proteinen vom Endosom zum Transgolgi-Netzwerk spielt insbesondere bei Membran-Rezeptoren beziehungsweise deren Liganden eine wichtige Rolle. Prominente tierische Beispiele sind Mannose-6-Phosphatrezeptoren und SNAREs; aber auch das Pflanzengift Ricin, ein Toxin, das von der Zelloberfläche zum ER wandert.

Die Transport- und Recycling-Routen konnten bisher nur für einzelne Kandidaten mühsam, meist mithilfe von Knockdown- oder Knockout-Ansätzen, aufgedröselt werden. Wesentlich einfacher und auf alle mit dem grünfluoreszierenden-Protein-(GFP)-getaggten Proteine anwendbar, ist eine auf Nanobodies basierende Spionage-Strategie, die Martin Spiess' Gruppe vom Biozentrum der Uni Basel ausgetüftelt hat.

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Robust und hitzstabil

Nanobodies sind Miniatur-Ausgaben klassischer Antikörper: Sie erkennen ihr Ziel spezifisch, bestehen aber nur aus einer Proteinkette (anstatt vier). Sie sind circa ein Zehntel so groß wie klassische Antikörper und somit wendiger, durchdringender und auch robuster. Eine höhere Hitze-Stabilität zeichnet diese ursprünglich aus Cameliden (Kamelfamilie) genutzten Antikörper-Fragmente zusätzlich aus.

Martin Spiess´ Team kommt bei der Nanobody-Gewinnung ohne Kamele oder Lamas aus, die Gruppe produzierte sie mithilfe rekombinanter Protein-Expression in E. coli. In einem Vorzeige-Beispiel stellten die Basler Nanobody-Fusionen mit einem funktionellen Anhängsel her. Als Nanobody-Grundgerüst diente der gut charakterisierte anti-GFP-Nanobody VHH GFP (gegen GFP gerichteter standardisierter Kameliden-Antikörper). Als Kandidaten-Proteine verwendete die Gruppe GFP-getaggte Membran-Rezeptoren, die sie mittels retroviraler Transduktion in Säugetier-Zelllinien schleuste.

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Radiographisch verfolgt

Die Forscher statteten VHH GFP zum Beispiel mit einem Motiv zur Tyrosin-Sulfatierung aus, um den retrograden Transport zum Transgolgi-Netzwerk zu beobachten. Sulfatierung ist eine ausschließlich im Transgolgi-Netzwerk auftretende posttranslationale Modifikation. Die GFP-getaggten Membran-Rezeptoren der Zellen nahmen die Nanobodies auf und kolokalisierten mit diesen. Mithilfe von 35S-markiertem Sulfat verfolgte das Team die Aufnahme-Kinetik radiographisch. In einem zusätzlichen Experiment störte die Gruppe den Membran-Verkehr mit Brefeldin A (BFA), das Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren hemmt. In Gegenwart von BFA wurden die getaggten Membran-Rezptoren unverändert von den Zellen aufgenommen, die Sulfatierung wurde aber vollständig unterdrückt. Offensichtlich verhindert BFA den Transport der Membran-Rezeptoren in das Kompartiment, in dem die Sulfatierung stattfindet.

Die Nanobodies lassen sich aber auch ganz einfach mit dem Fluoreszenz-Mikroskop verfolgen. In diesem Fall nutzten die Basler Nanobodies mit einem mCherry-Tag. Auch diese erkannten das entsprechende GFP-tragende Rezeptor-Molekül und wurden zusammen mit diesem in das Retrograde-Transportsystem geleitet.

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Eingesperrte Proteine

Man kann die Nanobodies aber auch mit einer Enzymfunktion versehen und für zelluläre „Kriegseinsätze“ nutzen. Hängt am Nanobody zum Beispiel eine Peroxidase, ist eine gezielte Zerstörung von Endosomen möglich. Hierzu vermengt man Zellen, die GFP-Membran-Rezeptoren exprimieren, mit Peroxidase-gekoppelten Nanobodies. Nach einer Stunde gibt man Diaminobenzidin (DAB) hinzu. Die Peroxidase oxidiert DAB, wodurch sich ein Präzipitat bildet, das Proteine einsperrt, die sich in dem Kompartiment befinden. Ist ein Kandidaten-Protein daraufhin in einem Western Blot oder bei einer Immuno­präzipitation nicht mehr auffindbar, liegt es daran, dass es in seinem Kompartiment gefangen ist.

Die Schweizer könnten mit ihren funktionalisierten Nanobodies tatsächlich einen Stein ins Rollen bringen, denn ihre Technik ist nicht nur auf die Verfolgung des retrograden Transports von Oberflächen-Proteinen beschränkt.

Andrea Pitzschke

Buser D. et al. (2018): A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. PNAS, 2018 Jun 18. (Epub ahead of print)

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Letzte Änderungen: 27.06.2018

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