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Mikrobieller Plastikvernichter

(14.03.2018) Anreicherungen von Mikroplastik in Böden, Ozeanen und Organismen ist ein globales Problem. Eine Hoffnung, zumindest Teile davon wieder loszuwerden, ruht auf dem Bakterium Ideonella sakaiensis.
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(14.03.2018) Gehen wir mit Plastik so um wie bisher, wird es 2050 circa 33 Milliarden Tonnen Plastikmüll geben. Einziger Ausweg: Konsum stoppen und den schon vorhandenen Müll sauber loswerden. Letzteres könnten Mikroorganismen mit ihren Enzymen wie Cutinasen, Lipasen, Esterasen bewerkstelligen. Leider arbeiten diese aber nur im Zeitlupentempo und oft nur bei hoher Temperatur.

PET (Polyethylenterephtalat) ist ein Polyester aus Terephtalat (TPA) und Ethylenglykol (EG). Am effektivsten wird es von der 2016 entdeckten IsPETase des Bakteriums Ideonella sakaiensis zerlegt. Schon bei 30° C kommt diese auf Touren, ihre Leistung ist aber für industrielle Anwendungen noch immer ungenügend.

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Frisiertes Gen

Eine Gruppe um Kyung-Jin Kim von der Kyungpook National University in Korea hat sich die PETase aus I. sakaiensis vorgeknöpft, um sie genauer zu analysieren. Dazu synthetisierte sie das PETase-Gen und ließ bei dieser Gelegenheit gleich die Sequenz für das Signalpeptid weg. Zusätzlich tauschte die Gruppe ein paar Nukleotide aus, um das Codon-Usage zu optimieren. Anschließend klonierte Kims Team das frisierte PETase-Gen in einen Expressionsvektor und transformierte damit E.coli-Zellen. Die rekombinante, mit einem His-tag versehene PETase reinigten die Koreaner schließlich über Nickel-Agarose Säulen.

Nach der Kristallisation des Enzyms und der Röntgenstrukturanalyse konnten Kims Mitarbeiter die Struktur der IsPETase mit einer Auflösung von 1.5 Å bestimmen. Das Enzym tritt als Monomer auf und ist ein Vertreter der alpha/beta-Hydrolase-Superfamilie. Wie andere Lipasen und Esterasen auch, enthält das aktive Zentrum ein konserviertes Serin-Hydrolase-Motiv.

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Substrat in der Klemme

Die IsPETase zerlegt PET in Bis-2-Hydroxyethyl Terephtalat (BHET) und Mono-2-Hydroxyethyl-Terephtalat (MHET) sowie Terephtalat. Zudem hydrolysiert es BHET zu MHET. Wie aber kriegt die Enzym-Schere im aktiven Zentrum ihr Substrat in den Griff?

Ko-Kristallisationsversuche mit BHET schlugen fehl. Vermutlich weil BHET aufgrund seiner schlechten Löslichkeit nur in niedriger Konzentration vorliegt. Die Koreaner wichen deshalb auf das künstliche IsPETase-Substrat 2-HE(MHET) 4 aus, das aus vier MHET-Einheiten besteht - und hatten damit Erfolg. Neben der katalytischen Triade fanden sie die Substrat-Binderegion, die aus zwei Teilen besteht und das Substrat asymmetrisch in die Klemme nimmt: Der erste Teil greift sich eine MHET-Einheit, der zweite die übrigen drei. Disulfidbrücken sorgen für die Stabilität des Enzyms.

Welche Aminosäuregruppen für Schnitt, Substratbindung und Disulfidbrücken unerlässlich sind, untersuchten die Koreaner anhand mutierter IsPETase-Varianten, die sie in Aktivitätsmessungen einsetzten. Für die Enzym-Assays verwendete die Gruppe zunächst BHET als Substrat. Das nach dreißig Minuten bei 30°C als Spaltprodukt freigesetzte MHET quantifizierten sie mittels HPLC. Als realitätsnäheres Substrat diente daraufhin ein PET-Film aus dem die Forscher kleine Stückchen mit einem Bürolocher stanzten. Den Verdau beziehungsweise die Freisetzung von MHET sowie TPA maßen sie erneut mit einer HPLC. Da die Spaltung des PET-Films deutlich langsamer erfolgte als die von BHET, nahmen Kims Mitarbeiter die vierfache Menge PETase und ließen dem Enzym mit 18 beziehungsweise 36 Stunden wesentlich mehr Zeit.

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Austausch erhöht Aktivität

Die Gruppe vermutete, dass ein exponierter Arginin-Rest (Arg280) die Bindung langer PET-Polymere verhinderte. Der Tausch gegen einen kleineren, hydrophoben Alanin-Rest an dieser Stelle sollte also die Bindung längerer PET-Substrate erleichtern und hierdurch die Aktivität der entsprechenden IsPETase R280A erhöhen. Tatsächlich hydrolysierte IsPETase R280A den PET-Film deutlich effektiver als die Wildtyp-PETase. Bei Versuchen mit dem kurzkettigen Substrat BHET fand die Gruppe dagegen keinen Aktivitätsunterschied.

Vergleiche mit anderen PETasen, die deutlich niedrigere Aktivitäten aufweisen als die IsPETAse, deuteten vor allem auf Unterschiede in der zweiten Binderegion hin. Eine dort vorhandene Disulfidbrücke in der Nähe des aktiven Zentrums sorgt für die thermische Stabilität des Enzyms. In mutierten IsPETase-Varianten sank der Schmelzpunkt von etwa 47° C auf 33° C.

Für Alignment- und Phylogenie-Studien verwendete das Team die vollständigen Proteinsequenzen. Dabei fand es 69 PETase-Sequenzen, die sich in zwei Typen unterteilen ließen: Typ I und Typ II-PETasen. Die IsPETase zählt zu den Typ II-PETasen und fällt durch eine hohe Aktivität sowie eine zusätzliche Disulfidbrücke in der Nähe des aktiven Zentrums auf. In Typ I-PETasen fehlt diese Disulfidbrücke, ihre Aktivität ist zudem sehr viel niedriger. Allen PETasen gemeinsam ist eine klassische katalytische Triade aus Serin, Histidin und Asparagin im aktiven Zentrum.

Andrea Pitzschke



Letzte Änderungen: 14.03.2018

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