(28.02.2018) Als Substrat für die Luciferase verwendeten die Forscher das synthetische Luciferin-Analog AkaLumin. Bei der Umwandlung von AkaLumin entsteht Infrarot-Licht (677 nm), das tierisches Gewebe durchdringt. Bereits geringe AkaLumin-Dosen genügen, da sich die Substanz anders als Luciferin, gleichmäßig im Gewebe verteilt. Ein weiterer Vorteil ist, dass AkaLumin im Gegensatz zu Luciferin die Blut-Hirn-Schranke überwindet.
Das japanische Team vom Brain Science Institute, RIKEN, in Hirosawa startete das Projekt mit der selbstbewussten Hypothese, dass das System aus Leuchtkäfer-Luciferase (Fluc) und Luciferin von der Evolution noch nicht ausreichend optimiert wurde. Die Forscher nahmen sich daher Luciferase-Gene aus Glühwürmchen und Leuchtkäfern vor und stellten mit diesen Gen-Bibliotheken in E. coli her. Die Bakterienzellen kultivierten sie in Gegenwart von AkaLumin und fischten die am stärksten leuchtenden Kolonien heraus. Nach mehreren Runden Zufallsmutagenese und Selektion erhielten sie schließlich die Fluc-Variante Akaluc, bei der an 28 Positionen Aminosäuren ausgetauscht waren. Akaluc katalysierte die Umwandlung von AkaLumin in vitro sieben mal effektiver als das Original und war zudem thermostabiler.
Die japanische Gruppe fusionierte Akaluc und Fluc zunächst mit dem Fluoreszenzprotein Venus und transformierte HeLa-Zellen mit den Fusionsproteinen. Zellen, die Venus-Fluc oder Venus-Akaluc exprimierten, reinigten die Forscher mit einem Durchflusszytometer. Hierbei stellte sich heraus, dass HeLa-Zellen, die Akaluc exprimierten, 52-mal stärker leuchteten als Venus-Fluc-Zellen. Die Gruppe erklärt dies durch eine etwa viermal stärkere Expressionsrate und eine um den Faktor 13 stärkere Enzymaktivität.
Anschließend injizierte das Team Akaluc- oder Fluc-HeLa-Zellen in die Schwänze von Mäusen oder schleuste sie über Adeno-assoziierte Viren ins Gehirn der Tiere. Für die Biolumineszenz-Reaktion mit Akaluc genügten 100 µl einer 30mM AkaLumin-Lösung (für Fluc war die dreifache Menge Luciferin nötig). Wurden Akaluc-HeLa-Zellen intravenös in die Bauchhöhle injiziert, leuchteten nach kurzer Zeit die Lungenkapillaren der Mäuse. Aus der Injektion von Fluc-HeLa-Zellen resultierte hingegen nur ein kaum erkennbares Signal.
Besonders attraktiv ist das Akaluc/AkaLumin-System für die Hirnforschung. So lässt sich zum Beispiel die Biolumineszenz im Striatum lebender Mäuse per Video live mitverfolgen. Je nachdem, wie das Substrat verabreicht wird, variiert die Signalstärke: Intravenös ist sie am stärksten, gefolgt von der Injektion in die Bauchhöhle sowie der oralen Aufnahme.
Obwohl die Biolumineszenz nach der oralen Applikation schwächer ist, hat sie den Vorteil, dass die Mäuse nicht gepikst werden müssen und das Substrat quasi unbewusst aufnehmen. Das ist insbesondere für Verhaltensforscher interessant.
Credit: RIKEN
Das Team schleuste einen Promoter mithilfe eines viralen Vektors in die Mäusegehirne, der eine Verhaltensänderung induzierte. Hinter dem Promotor saß eine Venus-Akaluc-Fusion. Die Gruppe setzte die Mäuse anschließend einer ungewohnten Umgebung aus. Beim Wechsel von der vertrauten Behausung in einen Stryopor-Stall mit ethanolgeschwängerter Luft beziehungsweise einem Plastikeimer mit Essiggestank reagierten die entsprechenden Hirnareale der Mäuse mit einer zwei-bis dreifach erhöhten Biolumineszenz.
Andrea Pitzschke