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Fixierung zappelnder Zellen

(03.01.2018) Beim Lebendzell-Imaging dürfen die Zellen, auch bei längeren Aufnahmezeiten, nicht aus dem Focus des Mikroskops wandern. Ein simpler Trick verhindert dies auch bei Suspensions-Kulturen.
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(03.01.2018) In Geweben sind Zellen miteinander verankert und verändern ihre Position beim Mikroskopieren nicht. Anders sieht´s da bei Zellsuspensionen aus. Die Zellen schwimmen gemächlich im Kulturmedium herum oder düsen hektisch umher. Schnell verschwindet eine mobile Zelle, die gerade noch im Focus des Mikroskops lag, wieder aus dem Blickfeld. Subzelluläre Bestandteile kann man hierdurch nur schwer ausmachen und Konturen sind auf Fotos so verschwommen, wie die Umrisse eines Rennradfahrers beim Zieleinlauf.

Suspensions-Zellen lassen sich jedoch mit wenig Aufwand fixieren, ohne ihr Verhalten negativ zu beeinflussen. Wie einfach das geht, zeigt Joachim Denners Gruppe vom Robert-Koch-Institut in Berlin (J Biol methods). Für die Fixierung benötigt man lediglich etwas Agarose und eine Mikrowelle.

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Die Agarose (UltraPure) wird im gewünschten Medium aufgelöst, kurz erwärmt und auf den flachen Boden eines Kulturschälchens gegossen. Anschließend schneidet man ein etwa ein Quadratzentimeter großes Stück aus dem erkalteten Gel heraus und legt es behutsam auf eine Zellsuspension, die den Boden einer Kulturschale bedeckt.

Da Gel und Suspension dasselbe Medium zugrunde liegt bleiben osmotische Effekte aus, die Zellen nehmen das Gel kaum als Fremdkörper wahr. Je schwerer das Gel-Pad, desto höher ist auch der Druck auf die Zellen. Zu dünne Gel-Pads sind jedoch bruchanfällig. Die Berliner Forscher erzielten mit ein Millimeter dicken Gel-Pads aus einprozentiger Agarose die besten Resultate.

Jurkat-Zellen (humane T-Lymphozyten) in RPMI-Medium, die Denners Mitarbeiter durch ein Agarose-RPMI-Pad fixierten, waren auch nach zwei Stunden noch intakt und vital (87 Prozent mit Agarose; 95 Prozent ohne Agarose). Die Forscher wiesen dies unter anderem anhand der Laktat-Dehydrogenase Aktivität im Überstand nach, die Schäden an der Zellmembran signalisiert.

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Wie scharf die Mikroskopbilder mit den fixierten Zellen werden, zeigte die Gruppe mit CD63-YFP-exprimierenden Zellen (CD63 ist ein Oberflächenprotein, das normalerweise mit Membran- und intrazellulären Vesikeln assoziiert ist. Es dient in der Medizin als Marker für die Aktivierung von Basophilen). Während nicht-fixierte Zellen mitsamt ihren Fluoreszenzsignalen binnen fünf Minuten einmal quer durch´s Bild wanderten, blieben die Zellen unter der Haube des Agarose-Pads artig sitzen.

Die Methode bietet noch einen zusätzlichen Vorteil: Da die Fixierung nur an der Zelloberfläche stattfindet, bleiben Bewegungen von Kompartimenten über einen längeren Zeitraum sichtbar. Bei den transgenen Jurkat-Zellen beobachteten die Berliner Forscher zum Beispiel, dass Filopodien sich hauptsächlich dort bilden, wo viel CD63-YFP vorkommt. Aus den Konfokal-Mikroskopie-Aufnahmen kann man zudem dreidimensionale Bilder generieren (die belegen: die Zellen bleiben kugelrund).

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Vermutlich funktionieren Agarose-Pads für alle möglichen Zelltypen. Sie schlagen mehrere Fliegen mit einer Klappe: Sie fixieren die Zellen, schützen sie vor Austrocknung und versorgen sie mit Nährstoffen. Kritisch wird´s wohl nur, wenn sowohl die Zellen im Medium als auch im Gel-Pad eine hitzeempfindliche Substanz benötigen, die in der Mikrowelle zerstört wird.

Die Zellen müsste man auch wieder vom Gel-Pad herunterspülen können. Und solange sie still halten und das Pad nicht als Last empfinden, ließen sich obendrein Wirkstoffe applizieren, die langsam durch das Pad diffundieren. Das wäre eine gute Alternative zur Wirkstoff-Applikation in Flüssigkulturen, die eher einer Schock-Behandlung gleicht.

Andrea Pitzschke


Letzte Änderungen: 03.01.2018

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