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Auf Effizienz getrimmtes CRISPR-Cas9-Editing

(13.12.17) Eine neue CRISPR-Cas9-Variante erhöht nicht nur die Effizienz des Editierens - mit ihr lassen sich auch richtig dicke DNA-Brocken in Genome einbauen.  

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© JHU

Wer Nukleotide in einem Genom austauschen will, erzeugt zunächst einen Doppelstrangbruch (DSB) in der Nähe des gewünschten „Edits“. Bei CRISPR-Cas9-basierten Techniken geschieht dies durch die Genschere Cas9.

Ohne weiteres Zutun verschließt der zelleigene Reparaturmechanismen den Schnitt wieder. Die Zelle verwendet hierzu DNA, die homolog zu den flankierenden Sequenzen der Bruchstelle ist. Mogelt man ihr während dieser Homologie gerichteten Reparatur (HDR) eine Donor-DNA unter, welche die gewünschte Sequenzänderung trägt, wird diese in die Bruchstelle eingebaut.

Für die Donor-DNA gelten aber recht strenge Kriterien und insbesondere der Einbau langer DNA-Fragmente ist mit den gängigen CRISPR-Cas9 Techniken schwierig. Geraldine Seydouxs Gruppe von der Johns Hopkins University dachte sich deshalb eine neue CRISPR-Cas9-Strategie aus, mit der sich bis zu 1000 Nukleotide lange Fragmente zügig und effektiv in Genomen unterbringen lassen (PNAS).

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Die Technik der amerikanischen Forscher unterscheidet sich in einem wesentlichen Punkt von den bisherigen CRISPR-Cas9-Verfahren: Das einzubauende DNA-Molekül gelangt nicht als Bestandteil eines zirkulären Plasmids in die Zelle, sondern als lineares PCR-Fragment.

Wie funktioniert das Verfahren? Die Forscher schleusten den Cas9-gRNA-Komplex entweder per Nukleotransfektion in Maus- beziehungsweise Humanzellen ein oder transfizierten die Zellen mit einem Cas9-codierenden Plasmid. Ganz klassisch erzeugte gRNA-Cas9 in den Zellen einen Schnitt an der gewünschten "Sollbruchstelle" der DNA. Als Donor-DNA diente ein doppelsträngiges PCR-Fragment, mit kurzen Sequenzen an rechtem und linkem Arm, die zur Bruchstelle homolog waren.

Wie die Forscher in Maus- und Humanzellen zeigten, lassen sich mit der Technik vollständige Gene in den Bruchstellen unterbringen. Die PCR-Fragmente spritzten sie direkt in Maus-Zygoten oder schleusten sie per Nukleofektion in humane Zellen. Systematisch testeten die Wissenschaftler die Längen-Anforderungen beziehungsweise Grenzen von Donor-DNA-Armen sowie Insert. Dabei kamen sie auf ein Armlängenoptimum von 35 Basenpaaren. Die Schmerzgrenze des einzubauenden Fragments lag bei circa 1kb; ansonsten galt: Je kürzer, desto effizienter.

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Maximal 1kb lange DNA-Abschnitte sind für den "Heimwerker" natürlich perfekt. Jeder Experimentator kann diese schnell und billig mit einer PCR herstellen und als Primer die entsprechenden Armsequenzen verwenden.

Je nach Länge und Konzentration der Donor-DNA (ca. 0,2 bis 0,3 µM) erreichte das Team Einbauraten von zehn bis fünfundvierzig Prozent. Hierfür musste es nicht aufwändig jedes einzelne DNA-Molekül sequenzieren, sondern bediente sich eines Tricks: Die Donor-DNA enthielt ein GFP-Gen, wodurch die Forscher mit einem Durchflusszytometer oder einem Fluoreszenz-Mikroskop sehr schnell zwischen Erfolg und Misserfolg unterscheiden konnten.

Beim Effizienztest kürzerer Inserts half ein Split-GFP-Konzept: Die Zellen exprimierten bereits einen großen (nicht-leuchtenden) N-terminalen Teil von GFP. Der erfolgreiche Einbau des noch fehlenden C-terminalen Stücks brachte sie zum Leuchten.

Wie sich bei der anschließenden Sequenzierung heraus stellte, liefen die meisten Editierungen nach Plan - es traten aber auch einige Ausreißer mit verschobenen Leserahmen (Frame-Shifts) oder fehlenden Enden auf.

Genau diese Fehler halfen den Forschern, ein Muster zu erkennen und so den Genom-Editing-Mechanismus aufzudröseln. Die meisten fehlerhaft eingebauten GFP-Sequenzen hatten an ihrer intakten Seite einen planmäßigen Übergang zur Einbaustelle. Die angeknabberte Seite dagegen mündete in Indels und anderen Fehlern.

Die Gruppe schloss daraus, dass die Reparatur asymmetrisch verläuft und sich mit dem sogenannten Synthesis-dependent Strand Annealing (SDSA)-Modell erklären lässt: Cas9 durchtrennt den Doppelstrang, wodurch 3´-Überhänge an beiden Seiten entstehen. Anschließend kommt es zur Stranginvasion und DNA-Synthese: Die Überhänge paaren sich mit den komplementären Strängen der Donor-DNA und werden im Zuge der DNA-Synthese verlängert. Beim anschließenden Annealing-Schritt verabschiedet sich der neu-synthetisierte Strang von der ursprünglichen Donor-DNA (die diente nur als Vorlage) und schmiegt sein jüngstes Ende an die noch freie Bruchstellenseite. Nach der Ligation ist die endgültige Wundheilung schließlich abgeschlossen.

Wie das Forscherteam aus systematischen Experimenten (vor allem mit rechten oder linken Donor-Armen) schlussfolgerte, hängt die Initiation der DNA-Synthese vom Homologiegrad der Donor-DNA-Arme ab. Dadurch ergibt sich neuer Manipulationsspielraum. Ist etwa der linke Arm perfekt homolog, der rechte aber nicht, so wird der Einbau von links nach rechts stattfinden. Bei zwei perfekten Armen kann er prinzipiell von der rechten oder linken DSB-Seite erfolgen.

Das SDSA-Modell erleichtert das Design optimaler Donor-DNA. Aus ihm folgt zum Beispiel, dass sich manipulierte Sequenzen auch in einiger Entfernung von der Bruchstelle unterbringen lassen.

Funktioniert hat das ganze bisher in Maus- und Humanzellen, die Technik wird aber vermutlich auch auf andere Organismen anwendbar sein.

 

Andrea Pitzschke

 



Letzte Änderungen: 21.12.2017

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