Proteom-Analysen erfassen zumeist nur das durchschnittliche Molekülrepertoire einer Zellpopulation und nehmen keine Rücksicht auf individuelle Zelltypen. Gewebe, wie zum Beispiel jene des Gehirns, bestehen aber aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen. Mit der neuen Markierungs-Technik, die eine Gruppe um Erin Schuman vom Max-Planck-Institut für Hirnforschung in Frankfurt austüftelte, können Forscher Veränderungen der Proteinzusammensetzung in vorab definierten Zelltypen von Mäusen beobachten, die zum Beispiel bestimmten Umweltreizen ausgesetzt sind (Nature Biotechnol).
Die neugebildeten Proteine werden mithilfe eines Affinitäts-Tags aus dem Probenextrakt herausgefischt und mittels Massenspektrometrie bestimmt. Die Technik besteht im Wesentlichen aus fünf Komponenten: einem mutierten Enzym der Proteinbiosynthese, einem nicht-natürlichen Aminosäure-Analog, einem Zelltyp-spezifischen Promotor, dem Cre-Lox-System sowie einem Affinitäts-Tag, der mittels „Click“-Reaktion angebracht wird.
Was heißt das konkret? Zunächst jubelt der Experimentator dem Proteinsynthese-Apparat, mithilfe einer mutierten Variante der Methionyl-t-RNA-Synthase (MetRS-L274G), das Methionin-Analog Azidonorleucin (ANL) als Kuckucksei unter. Das Ei wird nur "ausgebrütet", wenn Zellen MetRS-L274G exprimieren und Mäuse ANL über das Futter aufnehmen. Ein spezifischer Promoter legt den Wunschort für die MetRS-L274G-Expression fest.
Den Promoter aktivierten die Forscher elegant über das Cre-Lox System und die damit verbundene Kreuzung zweier Mauslinien. Die erste war „gefloxt“ und trug ein Konstrukt zur MetRS-L274G-Expression. Das Konstrukt wird erst nach einem entsprechenden Schnitt auf der DNA freigelegt. Die hierzu nötige Schere steuerte die zweite Mauslinie in Form der Cre-Rekombinase bei. Diese saß wiederum hinter einem Zelltyp-spezifischen Promoter: CaMK2a oder GAD2 für die Expression in erregenden Zellen des Hippocampus beziehungsweise in hemmenden Neuronen des Kleinhirns.
Die Cre-Rekombinase wurde im Zelltyp synthetisiert, den die zweite Mauslinie vorgab, und gab so den Anstoß zur MetRS-L274G -Expression. Da die mutierte t-RNA-Synthase zudem ein Grünfluoreszierendes Protein trug, konnte die Forscher sie in situ per Fluoreszenzmikroskop detektieren. Fütterten sie ANL in Form eines „Soft Drinks“ mit extra lecker Maltose, damit die Mäuse auch reichlich davon aufnahmen, so wurden die Proteine im vorgegebenen Zelltyp markiert. ANL diffundiert zwar auch in andere Zellen und Gewebe, diese wissen jedoch mangels MetRS-L274G nichts mit der nicht-natürlichen Aminosäure anzufangen.
Das Team um Schuman musste aber noch eine weitere Nuss knacken: Das Methionin-Analog ANL per se sendet keine messbaren Signale aus. Die Forscher mussten es mittels Click-Reaktion mit einem Tag dekorieren. Erst dann konnten sie in Querschnitten von Mäusegehirnen in den erwarteten Regionen (erregende Neuronen des Hippocampus) Fluoreszenz-Signale beobachten. Auch wenn die Mäuse vermutlich wenig Spaß dabei hatten, nennt die Gruppe diese Strategie FUNCAT (Fluorescent Noncanonical Amino Acid Tagging).
Um herauszufinden, an welchen Proteinen die Zellen besonders eifrig basteln und um etwaige Zelltyp-abhängige Unterschiede festzustellen, verwendeten die Forscher eine ähnliche Technik (BONCAT; Bioorthogonal Noncanonical Amino Acid Tagging). Ist das Hirn erst einmal aufgeschnitten (FUN), lässt sich auch Probenmaterial für die Proteinextraktion entnehmen. Somit können FUN- (Mikroskopie) und BON-Daten (Western Blot/ Massenspektrometrie von Extrakten) parallel von derselben Maus gesammelt werden. Für die Affinitäts-Aufreinigung der markierten Proteine nutzte das Team einen Biotin-Tag.
Bei der anschließenden Massenspektrometrie traten schließlich Zelltyp-spezifische Unterschiede bei der Proteinzusammensetzung zu Tage. So stellte sich heraus, dass in erregenden Neuronen des Hippocampus bestimmte Proteine angereichert beziehungsweise abgereichert sind. Wenig verwunderlich gehörten hierzu viele mit Krankheiten wie Alzheimer, Parkinson sowie Creutzfeld-Jakob assoziierte Vertreter.
Wieviel Dynamik das Proteom im Hirn agiler Mäuse entwickelt, untersuchte das Team in einem Vergleichstest von zwangsweise trägen und sportlich-agilen Mäusen. Allein für das Foto des mit Labyrinth, Laufrad etc. bestückten Käfigs lohnt sich ein Blick in das Original-Paper. Im Gegensatz zu einem öden Käfig führte eine sensorisch angereicherte Umgebung binnen drei Wochen zu beachtlichen Veränderungen im Proteom des Hippocampus. Diese zeigten sich insbesondere bei Proteinen mit Neuronen- und Synapsenfunktionen.
Fast nebenbei liefert die Studie eine weitere nützliche Information: ANL kann offenbar die Blut-Hirn-Schranke überwinden - sonst wäre es nach dem Trinken nicht in Zellen des Gehirns angekommen.
Andrea Pitzschke