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Die Methode, die ein deutsch-amerikanisches Team um den Gießener Biochemiker Marc Schetelig in den Scientific Reports vorstellte, basiert auf dem Cre/lox-Rekombinase-vermittelten Genkassettenaustausch (Cre-RMCE) mit dem sich gezielt, reversible Modifikationen (SSM) in das Genom von Aedes aegypti einführen lassen. Ziel der Gruppe war es, die Gelbfiebermücke als Krankheitsüberträger unschädlich zu machen, ohne sie in ihrer Fitness zu beeinträchtigen.
Katalysiert durch die Cre/lox-Rekombinase rekombinieren beim RMCE-System homospezifische Abschnitte (zum Beispiel lox oder FRT) an den Enden von Zielsequenz und Donorplasmid miteinander. Die Genkassetten, die jeweils zwischen den heterospezifischen Enden von Donor und Zielsequenz liegen werden hierdurch ausgetauscht. Da die heterospezifische Stelle der Zielsequenz bei diesem Prozess wiederhergestellt wird, können Forscher Modifikationen an dieser Stelle beliebig wiederholen.
Die Gruppe integrierte zunächst ein loxN-PUbAmCyan-lox2272-Plasmid an unterschiedlichen Stellen des Gelbfiebermückengenoms und stellte so vier transgene Linien her. Für den vollständigen Austausch der PUbAmCyan-Kassette waren anschließend zwei Rekombinationsrunden nötig.
In der ersten injizierten die Forscher ein loxN-3xP3AmCyan-lox2272-Plasmid zusammen mit einem Cre-Rekombinase-Plasmid in Embryonen der zuvor generierten Gelbfiebermückenlinien. Hieraus ergaben sich zwei Möglichkeiten: Das Spenderplasmid konnte per Einzelrekombination vollständig integriert werden (loxN oder lox2272) oder die PUbAmCyan-Genkassette konnte durch doppelte Rekombination gegen 3xP3AmCyan ausgetauscht werden (RCME).
Aus PCR-Experimenten schlossen die Forscher, dass in allen Fällen das gesamte Spenderplasmid im Zielgenom an der loxN- oder der lox2272-Stelle eingebaut wurde - es hatte also kein Kassettenaustausch durch RCME stattgefunden.
Alle Mücken-Linien beherbergten jedoch jeweils zwei Paare mit homospezifischen lox-Stellen. Dies nutzte die Gruppe, um den Kassettenaustausch in einer weiteren Rekombinationsrunde über einen Ausschneideprozess zu erzielen. Die Forscher injizierten hierzu ein Cre-Rekombinase-Plasmid in Mückenembryonen, die das loxN-3xP3AmCyan-lox2272-Plasmid an der loxN-Stelle integriert hatten. Rekombinierte loxN mit loxN so wurde die 3xP3AmCyan-Kassette ausgeschnitten, die erste Rekombinationsrunde wurde also wieder umgekehrt.
Die Rekombination von lox2272 mit lox2272 führte hingegen zum Ausschneiden der PUbAmCyan-Kassette und damit zur gewünschten transgenen Linie, die anstelle von PUbAmCyan, 3xP3AmCyan exprimierte.
Das Besondere der Cre-RCME-Technik gegenüber anderen SSM-Methoden, wie phiC31-RMCE und CRISPR, ist der Erhalt der Rekombinationsstellen. Die Forscher sind hierdurch in der Lage, die Modifikation jederzeit wieder umzukehren oder die gleiche Stelle weiter zu modifizieren, etwa durch Integration anderer Kassetten oder Ausschneiden unerwünschter Sequenzen. Ein weiterer Vorteil ist, dass im Gegensatz zu CRISPR/Cas offensichtlich keine Off-Target-Effekte auftreten.
Scheteligs Mitarbeiter fanden zudem eine Integrationsstelle im Genom der Gelbfiebermücke, die für genetische Modifikationen besonders geeignet ist.
Und theoretisch müsste der Genkassettenaustausch auch in einem Schritt möglich sein. Der Gruppe um Schetelig dürfte die Arbeit also nicht so schnell ausgehen.
Christine Haselier