Die Enden des Transposons bilden zwei kurze Sequenzen (Inverted Repeat, IR), zwischen die beliebige Gene oder DNA-Sequenzen eingefügt werden können. Hüpft das Transposon in ein Genom, so landet auch die dazwischenliegende Sequenz in dem gewünschten Genom. Verantwortlich für diesen Prozess ist das Enzym Transposase, das IRs erkennt, die Sequenz zwischen diesen herausschneidet und sie bei Kontakt mit DNA irgendwo wieder einbaut.
Die gängigen Strategien, die diesen Mechanismus für die gezielte Modifikation von Genomen ausnutzen, basieren auf der Co-Expression der Transposase auf einem zweiten Plasmid oder auf einem Fusionsplasmid, um sie zusammen mit dem Zielgen zu exprimieren. Andere Techniken nutzen die Co-Transfektion Transposase-kodierender mRNA.
Die Transposaseaktivität lässt sich auf diese Weise aber nur schwer steuern: Eine geringe Aktivität führt zu einer schlechten Integrationseffizienz, eine übermäßige Aktivität birgt hingegen die Gefahr, dass sich das Transposon unkontrolliert an weiteren Stellen des Genoms ausbreitet. Die Transposase wird nur für eine einzige Integration benötigt. Bleibt sie nachhaltig aktiv, richtet sie mehr Schaden an als dass sie nutzt.
Diesen Makel hat ein Team um den Mikrobiologen Christopher French von der Universität Edinburgh beseitigt (NAR). Die Gruppe schleuste die Transposase nicht in Form eines Gens oder einer mRNA in die Zielzelle, sondern als rekombinantes Protein, das nur eine begrenzte Überlebensdauer besitzt. Die Menge und das optimale Verhältnis zur Donor-DNA lässt sich so exakt einstellen.
Die Schotten exprimierten hierzu die zwei Transposasen, Mos1 und Mboumar-9, als N-terminale GFP-Fusionsproteine mit einem zusätzlichen His-Tag in E. coli und reinigten sie über Nickel-Säulchen. Als Donor-DNA verwendete die Gruppe ein Antibiotikum-Resistenzgen (KanR), das sie beidseitig mit circa 30 Basenpaaren-langen spezifischen IRs versah.
Die Gruppe transformierte zunächst chemisch- oder elektrokompetente E. coli-Zellen mit Donor-DNA und Transposase und verifizierte den Einbau anhand von Southern-Blots mit IR-spezifischen Sonden. Die exakte Position der integrierten DNA ermittelten die Forscher durch EcoRI-Verdau genomischer DNA mit anschließender Klonierung beziehungsweise inverser PCR.
Der Vorteil der Methode liegt jedoch in der leichten und stabilen Transfektion von Säugerzellen. Tatsächlich nehmen HeLa- und HEK293H-Zellen artig Fremd-DNA und Transposase auf, wenn diese mittels Lipo-Transfektion in die Zellen bugsiert werden. Da die Sequenz des hierbei als Donor-DNA verwendeten G418-Resistenzgens bekannt ist, lässt sich mittels inverser PCR die Integrationsstelle ermitteln.
Und wozu der GFP-Tag an der rekombinanten Transposase? Mit diesem verfolgten die Schotten den Weg des Proteins mit der Lebendzell-Mikroskopie. Binnen 80 Minuten kommt die Transposase im Cytoplasma an, bildet dort nach circa drei Stunden Aggregate, wandert nach acht Stunden durch die Kernhülle, um zwanzig Stunden nach der Transfektion endlich im Zellkern anzukommen. Dort findet die Transposition statt, gleichzeitig wird die Transposase allmählich proteolytisch abgebaut.
Forschern, die kommerzielle Kits zur Insertionsmutagenese, zum Beispiel mit Tn5, Mu oder Tn7-Transposon, routinemäßig einsetzen mag die schottische Methode kleinkariert erscheinen. Da die Transformation bei den Kits aber nur mithilfe der Elektroporation oder Mikrooinjektion funktioniert, sind diese, im Gegensatz zur Technik der Edinburgher Gruppe, nicht für den Hochdurchsatz geeignet.
Andrea Pitzschke