(7.12.16) Der Photorepzeptor RsLOV aus Rhodobacter sphaeroides formt im Dunkeln Homodimere, die unter Blaulicht reversibel dissoziieren – ein (fast) perfekter Schalter also, um Proteine ein- und auszuschalten.
Verknüpft man RsLOV mit einem Effektorprotein, so blockieren die im Dunkeln entstehenden RsLOV-Homodimere dessen Funktion. Bestrahlt man das Konstrukt hingegen mit Blaulicht, so lösen sich die Homodimere voneinander, wodurch das Protein wieder aktiv ist.
Die Gruppe des Photorezeptor-Spezialisten Andreas Möglich von der Universität Bayreuth suchte sich jedoch kein beliebiges Effektorprotein aus, das sie mit RsLOV ein und ausschalten wollte (Nucleic Acids Res, 20, 10003-14). Die Bayreuther wählten hierzu die Nuklease Cas9 des CRISPR/cas Systems. Aus naheliegenden Gründen: Eine schaltbare Cas9-Nuklease würde die Präzision von CRISPR/cas deutlich verbessern. Gleichzeitig erleichtern die existierenden, effizienten Cas9-Screening-Assays die Arbeit.
Zunächst mussten die Forscher jedoch herausfinden, an welchen Positionen sich die Sensordomäne von RsLOV in Cas9 einbauen ließ, ohne dessen Stabilität und Funktion zu beeinträchtigen. Möglichs Mitarbeiter verwendeten dazu einen simplen Trick. Sie fügten RsLOV an beliebigen Stellen in die inaktive Cas9-Nuklease (d)Cas9 ein. Anschließend durchsuchten sie die entstandene RsLOV-(d)Cas9-Bibliothek mit einem Fluoreszenz-Assay nach der gewünschten Variante.
Hierzu schleuste die Gruppe drei Gen-Konstrukte in E. coli Zellen ein. Plasmid Nummer Eins beherbergte (d)Cas9 unter Kontrolle eines Arabinose-Promoters. Der zweite Vektor enthielt ein RFP-Gen (mit vorgeschaltetem IPTG-Promoter), das für das Rotfluoreszierende Protein (RFP) kodiert. Plasmid Nummer drei diente schließlich zur konstitutiven Expression von gRNAs, die zu unterschiedlichen Regionen im RFP-Gen homolog waren.
Die Forscher zogen die Zellen unter Blaulicht oder im Dunkeln an und gaben schließlich Arabinose zu, um die Synthese von (d)Cas9 anzuschmeißen. Nach einer Weile folgte IPTG, um auch die Transkription des RFP-Reportergens in Gang zu setzen. Band das exprimierte (d)Cas9 hierauf an das RFP-Gen, so blockierte es die RFP-Transkription und damit auch die RFP-Fluoreszenz.
Mit einem Durchflusszytometer fischten die Forscher schließlich RsLOV-(d)Cas9-Varianten heraus, die die RFP-Transkription unter Blaulicht inhibierten und im Dunkeln wieder zuließen. Ins Netz gingen ihnen jedoch nur drei von mehr als 200 Kandidaten. Als einigermaßen brauchbar erwies sich nur ein Konstrukt, welches das RFP-Reportergen im Blaulicht etwas mehr als dreimal stärker reprimierte als im Dunkeln.
Eher zufällig fanden die Forscher während ihres Screenings jedoch eine sehr interessante Temperatur-sensitve (d)Cas9-RsLOV-Variante (temperature-sensitive RsLOV-Cas9, tsRC9) die nicht auf Licht sondern auf Wärme reagierte: Bei einer Temperatur von 29°C hemmte tsRC9 die RFP-Expression, bei 37°C war es dagegen inaktiv.
Dieser Temperatureffekt hängt offensichtlich nicht von der Position der RsLOV-Insertion ab und trat auch nicht auf, als die Gruppe anstelle von RsLOV ein sfGFP-Fragment einfügte. Das Team um Möglich vermutet, dass die Temperaturabhängigkeit von RsLOV selbst ausgeht. Die Bayreuther könnten sich deshalb vorstellen, RsLOV als Destabilisierungs-Domäne in Proteine einzubauen, um diese über die Temperatur an und ausschalten zu können.
Andrea Pitzschke