© PLOS ONE 4: e5506 CC-BY
DNA-Sequenzen punktgenau editieren – das ist seit dem Einzug der CRISPR/Cas9-Technologie mit erfreulich wenig Aufwand möglich. Seit 2012 driften umständliche Klonierungen in die Laborvergangenheit. Von Arabidopsis bis Weizen, von Biene bis Zebrabärbling, überall kommt CRISPR/Cas zum Einsatz.
Einmal verstanden und etabliert, eröffnet diese Technik kreativen Köpfen neue Anwendungen.
Wie die Science-Publikation einer Gruppe um den aus der Schweiz stammenden Entwicklungsbiologen Alexander F. Schier von der Harvard University zeigt, erlaubt sie auch einen bisher ungeahnt detaillierten Einblick in Entwicklungsprozesse ganzer Organismen (doi: 10.1126/science.aaf7907). Der Name der neuen Technik: GESTALT (genome editing of synthetic target arrays for lineage tracing).
Aber der Reihe nach. Als „Zelllinie“ bezeichnet man Zellen einer Gewebeart, die aus jeweils einer speziellen Vorläuferzelle hervorgehen. Ließen sich Zelllinien in komplexen Lebewesen während ihrer Entwicklung nachverfolgen, auf der Ebene einzelner Zellen, so erführe man genauer, wie Gewebe und Organe entstehen, und wann sich welche embryonale Stammzelle für eine gewebs-spezifische Differenzierung „entscheidet“.
Wie lassen sich also Zellen „verfolgen“? Das generelle Prinzip etablierter Ansätze ist, Zellen mit einer Markierung zu versehen, anhand derer sie später wieder identifiziert werden können. Um Zellen zielgerichtet in einem komplexen Zellgemisch (wieder) aufspüren zu können, müssen sie also mit einer in irgendeiner Weise detektierbaren Eigenschaft markiert werden. Die Markierung darf die normale Entwicklung dabei nicht beeinträchtigen.
Bisherige Methoden der Zelllinien-Verfolgung beruhen vor allem auf Färbung oder Enzym-vermittelter Markierung. Die Anzahl geeigneter Farbstoffe und Enzyme ist begrenzt. Man kann also nur eine Handvoll verschieden markierter Zellen in einem komplexen Zellgemisch beobachten. Zudem werden einmalig injizierte Farbstoffe bei jeder Zellteilung verdünnt, nach einigen Zellgenerationen verschwindet das Signal.
Methoden, die auf somatische Mutation setzen, umgehen diese Einschränkung.
Hier wird die Markierung (bzw. die Information dafür) bei jeder mitotischen Teilung weitergegeben. Sie akkumuliert entsprechend, das Signal wird insgesamt verstärkt.
Abkömmlinge einer Zelle, deren Genom irgendwo die Mutation XYZ trägt, tragen also dieselbe Mutation XYZ. Nur, um solche – zufällig im Genom verteilten – Mutationen nachzuweisen, muss jeweils das gesamte Genom sequenziert werden. Kostspielig. Zeitaufwändig. Als müsse man immer das ganze Buch lesen, um den exakten Wortlaut eines einzigen relevanten Satzes zu prüfen.
Hier kommt CRISPR/Cas ins Spiel, denn die Methode liefert die Seiten- und Zeilenangabe im Buch.
Dank CRISPR/Cas lässt sich der Genomabschnitt, in dem eine Mutation eingebracht wird, vorab genau festlegen. Es muss also nur dieser kurze Abschnitt sequenziert werden, egal welche und wie viele Mutationen darin auftreten. Solche künstlich erzeugten Allele sollten möglichst vielfältig sein. Je vielfältiger die erzielbaren Markierungsmuster, desto mehr Zellen eines Gemischs können einen individuellen Barcode tragen.
Genau dies ist der Gruppe um Schier und seinen Kollegen Jay Shendure von der University of Washington gelungen. Mit einem Konstrukt erzeugten sie Strich-Code-ähnliche Markierungsmuster: sehr viele Mutationskombinationen, aus zehn perlschnurartig angeordneten, leicht unterschiedlichen CRISPR/Cas9 (off)targets, die potentiell von ein und derselben single guide RNA (sgRNA) erkannt und somit mutiert werden können.
Wie erfährt man also, aus welchen Zelllinien ein bestimmtes Organ hervorgegangen ist? Man isoliere die genomische DNA, sequenziere den relevanten Abschnitt, an dem „die Perlenschnur eingeschleust wurde“ und schlussfolgere aus Anzahl, Art und Überlappungsgrad der Markierungsmuster auf die beteiligten Vorläuferzellen und deren Vewandtschaftsbeziehungen. So fanden McKenna et al., dass im ausgewachsenen Zebrabärbling der Großteil der Zellen eines bestimmten Organs von nur wenigen Vorläuferzellen abstammt. Dies gilt insbesondere für Blut, wo sie in 98 % der Zellen nur fünf verschiedene Markierungsmuster fanden.
Wer profitiert von dieser Entdeckung? Unmittelbare Nutznießer der GESTALT-Strategie sind Entwicklungsbiologen. Laut den Autoren lässt sich die Strategie relativ leicht auf andere Organismen übertragen. Langfristig sollte GESTALT helfen, Entwicklungsstörungen in Tiermodellen nachzubilden und zu verstehen. Auch die Entstehung und der Verlauf von Krebs könnte mit der neuen Technik besser nachzuvollziehen sein. Wenn man bedenkt, dass einige Medikamente spezifisch auf verschiedeneZelllinienund Entwicklungsstufen wirken, eröffnen sich hier neue, gezieltere Therapieansätze.
Andrea Pitzschke