Über die Tricks der Sequenzierkisten der dritten Generation hatten wir hier schon mehrfach berichtet (hier, hier und hier). Vor allem diejenigen Forscher, die das Kästchen MinION von Oxford Nanopore ausprobieren, berichten derzeit am laufenden Band über neue Anwendungen. Faszinierend ist der MinION auch wegen seiner Abmessungen: Das Ding ist nicht größer als ein Smartphone. Das beflügelt die Fantasie. Epidemiologen beispielsweise könnten eine Handvoll der Kisten mit ins Feld nehmen und direkt vor Ort Viren- oder Bakterienstämme klassifizieren, auch in abgelegenen Dörfern fernab von Kliniken und Laboren.
Ein Unterschied zum traditionellen Sanger-Verfahren ist allerdings, dass der Experimentator bisher nicht auswählen kann, welche Abschnitte der eingespeisten DNA sequenziert werden sollen. Beim langsamen Sanger-Sequenzieren arbeitet man mit spezifischen Primern und entscheidet somit vorab, welche DNA-Abschnitte abgelesen werden.
Der MinION funktioniert ganz anders. In der Box befinden sich mehrere hundert Nanoporen, durch die DNA-Abschnitte durchgeschoben werden. Der elektrische Stromfluss an den Poren wird laufend gemessen. Je nachdem, welche Basen gerade durch die Pore gleiten, verändert sich der Stromfluss; denn die vier Basen der DNA haben unterschiedliche stereometrische und chemische Eingenschaften und behindern damit den Ionenfluss durch die Pore auf charakteristische Weise. Diese Strom-Messungen, auch "Squiggles" genannt, bilden die Basis für die eigentliche Sequenzbestimmung, den "Base Call".
Oft will man aber gar nicht das ganze Genom sequenzieren, sondern nur möglichst schnell ganz bestimmte Bereiche abdecken, beispielsweise im Rahmen von Genotypisierungsstudien.
Genomiker aus Nottingham um Matthew Loose haben dem MinION jetzt einen neuen Trick beigebracht, um gezielt ausgewählte DNA-Abschnitte anzusteuern. Dabei nutzen sie zwei Besonderheiten des Poren-Sequenzierens: Zum einen kann man die Lese-Arbeit jeder einzelnen Pore in Echtzeit mitverfolgen, man schaut der Pore sozusagen bei der Arbeit über die Schulter.
Zum anderen kann man von außen jede einzelne Pore elektrisch ansteuern und die Spannung über die Pore individuell umkehren. Die Pore spuckt den DNA-Faden dann wieder aus.
Die Autoren zeigen nun in einem bei BioArxiv hinterlegten Preprint, dass man diese zwei Eigenschaften nutzen kann, um selektiv zu sequenzieren. Der Experimentator muss dazu einfach der Auswertungs-Software des MinION sagen, welche Zielsequenzen nicht interessant sind. Der Algorithmus analysiert in Echtzeit alle frisch in die Poren eingespeisten Sequenzen und gibt der Pore das Kommando zum Ausspucken, falls sie anfängt, einen uninteressanten Abschnitt zu sequenzieren.
So werden am Ende die gewünschten Zielsequenzen angereichert. Das spart Zeit und / oder ergibt eine höhere Abdeckung der tatsächlich interessanten DNA-Abschnitte.
Damit die gewünschte Zeitersparnis auch eintritt, muss die Entscheidung über Ausspucken oder Weitermachen blitzschnell fallen, bevor ein Großteil der jeweiligen DNA schon durch die Pore geschlüpft ist. Wenn die Software aber die "Squiggles" erst in DNA-Sequenz übersetzen müsste, würde die Auswahl-Prozedur zu lange dauern, wie die Autoren ausführen.
Loose und seine Kollegen sind deshalb einen anderen Weg gegangen. Anstatt "übersetzte" DNA-Sequenzen zu vergleichen, analysiert die Software direkt die Squiggle-Signaturen. Das ist methodisch ein wenig trickreich, aber sehr ähnlich dem Vergleich von Audio-Spuren. Folglich haben die Briten auch bei einer Methode Anleihen genommen, mit der Ähnlichkeiten zwischen Tonspuren aufgefunden werden können.
Funktioniert der kleine feine Trick auch in der Praxis? Das zeigen die Autoren mit zwei Testreihen. Einmal haben sie selektiv einen Abschnitt im Genom des Bakteriophagen Lamda sequenziert. Zum anderen konnten sie gezielt bestimmte Amplicons im Ebola-Genom ansteuern.
Anwendungen könnte die neue Methode vielleicht überall da finden, wo es um schnelle genomische Diagnosen im Feld geht, zum Beispiel während eines akuten Ausbruchs einer Infektionskrankheit.
Hans Zauner
Foto: Oxford Nanopore