Tipp 54: Alptraum "Leeres PCR-Gel" - Zehn kleine Killerlein:

Es gibt Dinge, die nerven schlimmer als Dauerjuckreiz. Für Zeitschriftenredakteure etwa sind's zugesagte Artikel, die drei Tage nach(!) Redaktionsschluss eintreffen, oder schlampige Texte, die man in selbstzerfleischender Kleinarbeit erst redigieren und dann noch um ein Drittel kürzen muß. Wissenschaftler haben da ganz andere Sorgen. Die regen sich gern auf über Diplomanden, die den Arbeitsbereich mit 32P vollkleckern, und die brave TA fährt aus der Haut, wenn der Postdok schon vor dem Nachmittagskaffee zum achten Mal die Waage mit Yeast Extract gepudert hat.

Noch etwas gibt's, was tierisch nervt, und das sind PCR-Gele, die am Abend eines arbeitsreichen Tages leer wie gegnerische Fußballtore bleiben. Ein ehemaliger Kollege meinte in solchen Fällen meist lakonisch: "Ja mei, man sieht halt ned nei ins Cup...". Das nicht, aber man kann bei der Wiederholung des Experiments doch ein paar potenzielle Fehlerquellen ausschließen. Zehn Dinge, "die Ihre PCR killen können", haben wir auf www.biowire.com gefunden. Nachfolgend die ersten vier:

• Zu viele dNTPs, oder degradierte dNTPs? Ersteres kann Ihre PCR inhibieren, letzteres die Taq-Polymerase arbeitslos machen. Die optimale Nukleotid-Arbeitskonzentration liegt zwischen 40 und 200 µM. dNTPs sind empfindlich gegen wiederholte Gefrier-Auftau-Zyklen, daher sollte man die Stammlösung aliquotieren und häufig eine neue Charge anfangen (und die alte vernichten, da sonst statt Ihnen die Kollegen wahnsinnig werden).
  
  
• Vergessen, die MgCl2-Lösung zu mischen? MgCl2-Lösungenbilden beim Einfrieren gerne einen Konzentrationsgradienten aus und sollten daher (nach dem Tauen) vor Verwendung gevortext werden.
  
  
• Falsche MgCl2-Konzentration? Eine PCR ist eine Enzymreaktion und hat daher logischerweise einen optimalen MgCl2-Konzentrationsbereich, normalerweise zwischen 1 und 4 µM. Mg2+-Ionen bilden mit den Nukleotiden (dNTPs) Komplexe und wirken zugleich als Cofaktor der eingesetzten Polymerase. Das Ermitteln der optimalen Mg-Konzentration ist mühsame Empirie.
  
  
• Inhibitoren im Versuchsansatz? Ist Ihnen eigentlich klar, welche verworrenen Wege Ihr wertvolles DNA-Template gegangen ist, ehe Sie den PCR-Mastermix drüberkippten? Hängen etwa noch Phenol, Chloroform, EDTA, ionische Detergenzien (SDS, Sarkosyl), Xylen Cyanol, Bromphenolblau oder Ethanol zwischen Basen und Phosphat-Rückgrat? Das inhibiert die Enzymreaktion, und das Template liegt im Cup wie ein toter Hund; exponentielle Vermehrung: Fehlanzeige. Geben Sie sich in diesem Fall einen Ruck und jagen Sie ihre Lösung nochmal über ein Reinigungssäulchen – geht schnell und kostet nicht viel.
  
  

• Schlechte Qualität des überschichtenden Mineralöls? Erfahrene Hobbyköche wissen: Öl ist nicht gleich Öl. Während Witzigmann und Co. neuerdings Kürbiskernpressungen bevorzugen, sollte der PCR-Experimentator (sofern er noch keinen Thermocycler mit Heizdeckel besitzt) auf Nuklease-freie Öl-Destillationen achten. Auch Erhitzen (im Autoklaven etwa) oder UV-Exposition ist von Übel: Dabei entstehen gerne Reaktions-inhibierende Hydrokarbon-Verbindungen. Behandeln Sie ihr PCR-Öl also nicht anders, als Sie es mit Ihrem hochwertigen Salatöl machen.
  
  
• Zu viel Polymerase eingesetzt? Dann droht der gefürchtete "Schmier" auf dem Analysegel: Unspezifisch synthetisierte DNA-Stücke unterschiedlicher Größen laufen genau da, wo Sie ihr gesuchtes Fragment vermuten und verdecken es gnadenlos. Viele scheinen stur 0,5 oder 1,0 µl Taq aus ihrer Stammlösung einzusetzen – doch meist genügt für ein gutes Ergebnis weit weniger.
  
  
• Falsche Primer-Konzentration? Primer, Primer, immer liegt's an den vermaledeiten Primern. Setzt man zu wenig ein, gibt's kein (oder unzureichend wenig) Reaktionsprodukt. Gibt man zu viel in den Ansatz, so dimerisieren die Dinger und beschäftigen sich erneut zu wenig mit ihrem eigentlichen Job: Der DNA-Amplifikation. Ideal sollten Konzentrationen zwischen 0,1 und 1,0 µM sein. Ausnahmen bestätigen die Regel.
  
  

• Cycler-Programm verwechselt? Klingt banal, ist es aber nicht, und nicht nur für vom Verfolgungswahn geplagte von Belang. Es muß keine Bösartigkeit dahinter stecken, wenn aus "40 Cycles bei 94/55/72 °C" plötzlich "25 Cycles bei 94/60/72 °C" wurden. Folientastaturen sind tückisch: Ein unbewußter Ausrutscher, ein ausgeleierter Flachknopf, und schon amplifizieren Sie ihre marginalen DNA-Spuren mit dem Programm, das der Benchnachbar gestern noch für seine Pfunds-Isolation verwendete...
  
  
• Zuviel / zu wenig Template? Weniger ist manchmal mehr, gerade in der PCR. Denn überschüssiges Template fängt Ihnen bereits während der Anfangszyklen vorzeitig die Primer ab. Zu wenig Template hingegen erbringt nur schwach oder gar nicht detektierbare DNA-Spuren auf dem Analyse-Gel. Erfahrungsgemäß sind für 25 bis 30 Zyklen 104 Template-Kopien ausreichend.
  
  
• Mangelhaftes Primer-Design? Hexenkunst ist nichts dagegen: Primer-Design benötigt viel Erfahrung. Offensichtliche Fehler wie Selbstkomplementärität oder extrem lange Primer (>30 bp) sollte man natürlich vermeiden. Im Zweifelsfalle ist es allemal schneller, sich neue, ähnliche Primer synthetisieren zu lassen als langwierig an Reaktionsbedingungen herum zu doktern.

Letzte Änderungen: 08.09.2004