Wer sehen will, was sich im Gehirn von Versuchstieren während bestimmter Verhaltensweisen abspielt, sollte sie dabei so wenig wie möglich stören. Mit dem NeuBtracker-Mikroskop funktioniert dies zumindest schon mal bei freischwimmenden Zebrafischlarven.
Es ist ein alter Traum der Neurowissenschaftler, einem Gehirn dabei zuzuschauen, wie es die Welt wahrnimmt, lernt und Handlungsentscheidungen trifft, ohne von der Beobachtung beeinflusst zu werden.
Unter dem Fluoreszenzmikroskop werden die Aktivitätsänderungen in fluoreszenzmarkierten Neuronen von Zebrafischlarven sichtbar. Bei den bisherigen Methoden mussten die Larven dazu aber fixiert werden, wodurch ihr natürliches Verhalten gestört wurde. Mit dem NeuBtrackerMikroskop können die Fluoreszenz- beziehungsweise Kalziumsignale dagegen auch in freischwimmenden Larven aufgezeichnet werden.
Foto: Labor Florian Engert, Harvard
Noch ist dieser Traum jedoch weit entfernt von der Realität. Lichtmikroskope dringen selbst mit der besten Multiphotonen-Technik nur wenige Millimeter in das Gewebe ein und können so zum Beispiel in der Maus nur ausgewählte Areale des Gehirns visualisieren. Nicht-invasive Bildgebungsmethoden sowie Magnetresonanztomographie, Optoakustik oder Ultraschall können zwar tiefer eindringen, sie erreichen jedoch keine zelluläre Auflösung. Zudem müssen für diese Methoden noch entsprechende molekulare Sensoren weiterentwickelt werden, um die Gehirnaktivität auf der zellulären Schaltkreisebene zu erfassen.
Eine sehr interessante Ausnahme ist jedoch die Zebrafischlarve. Sie ist wie die Maus ein Wirbeltier, aber so transparent und klein (ungefähr so groß wie ein Ausrufezeichen auf einer gedruckten Seite), dass man mittels klassischer Fluoreszenzmikroskopie etwa 100.000 Nervenzellen direkt im Gehirn sehen kann. Dabei kann man die Nervenzellen nicht nur lokalisieren – man kann ihre Aktivität sogar direkt auslesen. Hierzu misst man die Signaländerungen genetisch kodierter Fluoreszenzproteine, die in fast jeder Nervenzelle der Larve exprimiert werden können und bei Bindung des zentralen Botenmoleküls Kalzium ihr Fluoreszenzsignal stark erhöhen.
Trotz dieser exzellenten Eigenschaften wurden die Larven aber bisher immer während der Mikroskopie fixiert und/oder paralysiert, um ihre Gehirnaktivitätsmuster zu messen. Und obwohl in diesen Experimenten durch geschickte sensorische (meist visuelle) Präsentationen und Muskelableitungen –virtuelle Realitäten für die Larven geschaffen werden können, kann man sich nicht sicher sein, dass die natürliche Wahrnehmung und das natürliche Verhalten unverfälscht bleiben.
Unsere Gruppe an der Technischen Universität München und dem Helmholtz Zentrum München hat deshalb ein Open-SourceMikroskop gebaut, das wir NeuBtracker nennen (Nat. Methods 14, 1079-82).
Das NeuBtracker-Mikroskop verfolgt eine frei schwimmende Larve in einer Untersuchungs-Arena und misst simultan ihr Verhalten sowie ihre Gehirnaktivität. Dies gelingt durch die Synchronisation zweier Kamera-Aufnahmen: Während eine Infrarot-Kamera das Schwimmverhalten der Larve registriert, wird die dabei ermittelte Position des Kopfes und des Körpers in Echtzeit an ein Spiegelsystem geschickt, das automatisch das Sichtfeld einer zweiten Fluoreszenz-Kamera auf dem Gehirn zentriert.
Die einzelnen Bauteile des NeuBtrackers sind direkt von der Stange erhältlich. Mithilfe einer kompletten Teileliste sowie CAD-Bauplänen, die auf der NeuBtracker-Webseite erhältlich sind, können sie zu dem NeuBtracker-Mikroskop zusammengebaut werden.
Foto: Gil Westmeyer
Die Kalziumsignale im Gehirn können so auch im freischwimmenden Tier aufgezeichnet werden und nach einigen Bildverarbeitungsschritten bestimmten Gehirnregionen zugeordnet werden. Mithilfe von NeuBtracker beobachteten wir zum Beispiel, wie Larven ein aversives Geruchsmolekül erkennen und vermeiden, wenn dieses auf einer Seite einer zweigeteilten Arena in einer Öffnung eingeträufelt (instilliert) wird. Dabei konnten wir bei jedem Kontakt mit der Öffnung eine Aktivierung des Geruchssystems messen und mit dem parallel aufgezeichneten Vermeidungsverhalten korrelieren.
Auch die kombinierten Effekte neuroaktiver Stoffe auf das Verhalten und die Gehirnaktivität lassen sich so parallel erfassen. Wir zeigten dies anhand einer neurostimulierenden Substanz, die zu einem vorübergehenden Anstieg der Schwimmaktivität führte, gefolgt von einer Phase der Inaktivität. Parallel dazu maßen wir eine steigende neuronale Aktivität in mehreren Gehirnregionen.
Gegenwärtig sind wir dabei, das NeuBtracker-Mikroskop technisch weiter zu verfeinern. Ziel ist es, die Nervenzellaktivität genauer dreidimensional aufzulösen, und die Gehirnaktivität auch mittels optogenetischer Methoden zu beeinflussen. Auch gibt es neue Entwicklungen bei Fluoreszenz-Sensoren. So könnten Sensoren, die zum Beispiel Neurotransmitter oder interne Signaltransduktionskaskaden in Fluoreszenzsignale umsetzen, mit großer Wahrscheinlichkeit auch im genetischen Zebrafischmodell eingesetzt werden.
Wir wollen die neuen Möglichkeiten des NeuBtracker vor allem dazu nutzen, die neuronale Aktivität während definierter Perioden natürlichen Verhaltens zu messen. Dabei interessieren uns insbesondere die neuronalen Mechanismen und Prozesse, die bei einfachen Entscheidungsprozessen im Gehirn ablaufen. Das NeuBtracker-Mikroskop soll uns dabei helfen, diese fundamentalen Gehirnleistungen (im optisch transparenten und genetisch zugänglichen Zebrafischmodell) auf der Ebene der Gehirnschaltkreise zu verstehen.
Die Baupläne und Softwarekomponenten für das Mikroskop sind auf der Webseite NeuBtracker.org frei verfügbar. Wir hoffen, dass andere Labore Varianten des NeuBtrackers nachbauen und bei Neuroverhaltens-Experimenten in freischwimmenden Zebrafischlarven einsetzen, so dass wir gemeinsam Fortschritte im Verständnis neuronaler Schaltkreise machen können.
Gil Westmeyer
Gil Westmeyer entwickelt mit seiner Gruppe an der TU München Verfahren zur funktionellen Darstellung des Gehirns. Dazu kombiniert sein Team nicht-invasive Bildgebungstechniken mit bio- und nanotechnologischen Methoden. Das NeuBtracker-Mikroskop konstruierte er zusammen mit einer interdisziplinären Gruppe, der Forscher von der TUM sowie dem Helmholtz Zentrum München angehörten.