Feng Zhan. Foto: Twitter - Feng Zhan
Beim Patentstreit um CRISPR hat Feng Zhang vom MIT zuletzt einen Etappensieg errungen. Auch an der wissenschaftlichen Front scheint es bei ihm ganz gut zu laufen.
Gemeinsam mit James Collins‘ Gruppe vom MIT und weiteren Mistreitern von der Harvard Universität entwickelte Zhangs Team eine CRISPR/cas-basierte Diagnostikmethode (Science 10.1126/science.aam9321).
Die Forscher wählten hierzu ein CRISPR-System, das die RNAse Cas13a als Effektorenzym einsetzt, und kombinierten dieses mit der isothermalen Amplifikation von Nukleinsäuren durch Rekombinase Polymerase Amplifizierung (RPA). Die neue Technik taufte Zhang auf den Namen Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing oder kurz SHERLOCK.
Das Besondere an Cas13a ist dessen Affinität zu RNA. Die RNAase wird von einer CRISPR-RNA (crRNA) zu ihrer Ziel-RNA geführt und schneidet diese. Cas13a greift aber nicht nur am eigentlichen Ziel an. Es spaltet unspezifisch auch RNA-Moleküle, die sich in der Nähe des Targets befinden, und führt hierdurch zu Kolletaralschäden in der Zelle. Zhangs Gruppe nutzte dies für den spezifischen In-vitro-Nachweis von RNA und DNA.
Hierzu amplifizierten die Forscher doppelsträngige DNA per RPA. Mittels T7-RNA-Polymerase-Transkription schrieben sie die amplifizierte DNA in RNA um. Im nächsten Schritt inkubierten die Forscher die amplifizierte RNA zusammen mit Cas13a, einer crRNA sowie Reporter-RNA.
Cas13a-crRNA erkennt die Zielsequenz und zerlegt durch die unspezifische kollaterale RNase-Aktivität auch die Reporter-RNA. Die resultierende Fluoreszenz maß die Gruppe mit einem MikroplattenReader. Alternativ könnte man das Fluoreszenzsignal für die Vor-Ort-Diagnostik auch mit einem Handspektrophotometer erfassen. Im Prinzip lässt sich die Cas13a-Detektion durch SHERLOCK mit praktisch jeder Amplifizierungstechnik koppeln. Da die RPA unter isothermalen Bedingungen bei Körpertemperatur abläuft, ist sie perfekt für den Einsatz von SHERLOCK außerhalb eines gut ausgestatteten Labors geeignet, etwa um Infektionskrankheiten in Notfallsituationen oder Krisengebieten nachzuweisen.
Die Empfindlichkeit des Systems ist vergleichbar mit der etablierter Methoden, wie qPCR oder digitaler Tropfen-PCR. Darüber hinaus glänzt SHERLOCK mit kleinen Fehlerraten und benötigt zudem keine aufwendigen Laborgeräte. Die Technik funktioniert auch mit lyophilisierten Komponenten und lässt sich mit der von James Collins‘ Gruppe entwickelten Paper-Spotting-Methode durchführen. Bei dieser sind die nötigen Reagenzien in einen lagerfähigen Papierstreifen eingebettet, auf den die amplifizierte RNA nur noch aufgetragen werden muss.
Zhangs Mitarbeiter unterschieden mit SHERLOCK verschiedene Zika- und Dengue-Virenstämme und wiesen Zika-Viren in Blut- und Urinproben von Patienten nach. Ebenso spürten sie pathogene Bakterien auf und identifizierten zellfreie Tumor-DNA-Mutationen.
SHERLOCK kann aber auch für schnelle Genotypisierungen genutzt werden. Die Methode erkennt sehr präzise unterschiedliche Allele und ist genau genug, um auf einen homozygoten oder heterozygoten Genotyp schließen zu können. Man könnte die Technik aber auch für das Screening von Antibiotikaresistenzen oder in der Krebsdiagnostik einsetzen – und natürlich auch als kostengünstigen RNA/DNA-Nachweis für den Laboralltag.
Christine Haseliert