Himmlische Rettung für alle Lebenswissenschaftler, die gerade in der Klonierungshölle schmoren.
Wenn man ein DNA-Fragment mit klassischen Methoden in ein Expressionsplasmid klonieren will, muss man immer wieder aufs Neue nach geeigneten Restriktionsenzymen suchen und auf viele Details achten. So sollte der Leserahmen nach dem Verdau noch intakt sein, für das 5‘- und 3‘-Ende wären zwei verschiedene Restriktionsenzyme nicht schlecht und der Reaktionspuffer sollte zu beiden Restriktionsenzymen passen. Darüber hinaus muss man sowohl das PCR-Produkt als auch das Expressionsplasmid wiederholt aufreinigen und verdauen.
Nach der Transformation von E. coliZellen mit den Klonierungsansätzen führt kein Weg daran vorbei, die auf Agar-Platten wachsenden Kolonien, einzeln auf Plasmide mit korrekt ligiertem DNA-Fragment zu untersuchen. Oft genug enthalten sie jedoch nur das religierte Expressionsplasmid ohne Insert oder das Ausgangsplasmid.
Der Weg zur geklonten DNA ist voller Stolpersteine, aber es gibt Tricks, diese zu umgehen. Ein Beispiel ist die von unserer Gruppe am Molekularen Krebsforschungszentrum der Berliner Charité entwickelte pHeaven‘s Door Klonierung (pHD). Bei dieser fallen nicht nur die aufwendigen, nicht Hochdurchsatz-kompatiblen Schritte der Gel-Aufreinigung weg. Man vermeidet mit ihr auch die Suche nach Gen-spezifischen Schnittstellen sowie die Untersuchung einzelner Bakterienkolonien. Für die pHD-Klonierung kombinierten wir drei bekannte Klonierungstricks: den prokaryotischen Selektionsmarker-Wechsel, die Golden-Gate-Klonierung und die Integration eines Selbstmord-Gens (Mol Biotechnol. doi: 10.1007/s12033-014-9736-2).
Im Mittelpunkt des Golden-Gate-Clonings stehen Typ-IIs-Restriktionsenzyme wie BsaI, die doppelsträngige DNA außerhalb ihrer Erkennungssequenz schneiden. Da Erkennungs- und Restriktionssequenz räumlich getrennt sind, kann man mit einem einzigen Restriktionsenzym beliebige rekombinante Plasmide herstellen. Zudem kann man Restriktion und Ligation in einem Schritt durchführen. Ein erneutes Schneiden ist mit Typ IIs-Restriktionsenzymen ausgeschlossen, da die Erkennungssequenzen nach der erfolgreichen Ligation nicht mehr vorhanden sind.
Die Strategie des Selbstmord-Gens, mit der man den Hintergrund aus unverdautem oder religiertem Plasmid vermeidet, borgten wir uns von der Gateway-Klonierung. Das Selbstmord-Gen ccdb sitzt im Ausgangsplasmid zwischen den BsaI-Schnittstellen. Funktionieren Restriktion und Ligation, so wird es durch das gewünschte Insert ersetzt. Unverdaute oder religierte Plasmide besitzen dieses Gen jedoch weiterhin – und treiben die transformierten Bakterien dadurch in den Selbstmord.
Für die pHD-Klonierung konstruierten wir zwei Vektoren: pHD-Kan, der eingesetzt wird wenn das Ausgangsplasmid wie unten beschrieben einen Ampicillin-Marker trägt, und pHD-Amp für den Fall eines Kanamycin-Markers im Template-Plasmid. pHD-Kan enthält zusätzlich das durch zwei BsaI-Schnittstellen flankierte ccdB-Insert.
Mit einer PCR amplifiziert man die cDNA im Ausgangsplasmid und führt über die PCR-Primer BsaI-Schnittstellen an beiden Enden ein. Das PCR-Produkt und pHD-Kan inkubiert man anschließend bei Raumtemperatur für 30 Minuten mit BsaI und der T4 Ligase. Nachfolgend transformiert man damit E. Coli-Zellen und streicht diese auf Kanamycin-Platten aus.
Läuft alles glatt, wurde das Selbstmord-Insert von BsaI herausgeschnitten und das zu klonierende Gen durch die T4 Ligase korrekt in pHD-Kan eingesetzt. Der Kanamycin-Marker garantiert, dass nur E. coli-Zellen, die dieses Plasmid enthalten, auf der Kanamycin-Platte wachsen (beherbergt das Ausgangsplasmid einen Kanamycin-Marker, führt man das Protokoll entsprechend mit dem Vektor pHD-Amp auf Ampicillin-Platten durch).
Enthalten die Zellen dagegen den unveränderten Template-Vektor können sie auf der Kanamycin-Platte keine Kolonien bilden, weil dieser Vektor einen Ampicillin-Marker trägt. Auch Zellen, die einen pHD-Vektor beherbergen, bei dem das Selbstmord-Gen ccdB nicht durch BsaI herausgeschnitten wurde, haben schlechte Karten und gehen zu Grunde.
Die aufwendige Gel-Reinigung des PCR-Produktes kann man sich damit schenken, die übliche Reinigung über eine Säule reicht völlig aus. Durch die Kombination aus Selbstmord-Gen und Selektionsmarker-Wechsel entfällt auch das Ausplattieren der transformierten Bakterien auf Nährplatten und das anschließende Picken einzelner Klone – sämtliche Transformanten tragen den rekombinanten Vektor.
Stattdessen kann man die transformierten Bakterien über Nacht in einer Flüssigkultur anziehen und schon am Morgen nach der Transformation transfektionsfähige Plasmid-DNA isolieren.
Die pHeaven’s Door-Klonierung ist somit eine effiziente Kombination verschiedener Klonierungstechniken, die den Weg von der PCR-Reaktion zum Expressionskonstrukt deutlich verkürzt. Die pHD-Plasmide erhalten Sie unter carsten.groetzinger@charite.de.
Quirino Schefer,Sandy Hallmann, Carsten Grötzinger