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Tipp-Ex für Gene
Produktübersicht: Kits für Mutagenese und Genom Editierung


Vor 40 Jahren revolutionierten Restriktionsenzyme die rekombinante DNA-Technologie. Eine vergleichbare Umwälzung bahnt sich derzeit durch CRISPR-Cas und Co. beim Editieren von Genomen an.

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Baukästen, oder neudeutsch Kits, für die zielgerichtete (site-directed) Mutagenese von Genen gehören zur Grundausstattung von Molekularbiologen, die mit Hilfe der reversen Genetik mehr über die Funktion eines Gens herausfinden wollen. Meist enthalten die Kits die nötigen Bausteine für PCR- beziehungsweise Oligonukleotid-basierte Mutagenese-Techniken, wie Primer- und Overlap-Extension- sowie Megaprimer-PCR.

Primer-Verlängerung

So basieren zum Beispiel die in vielen Laboren anzutreffenden QuickChange-Kits auf einer Primer-Extension-PCR mit linearer Amplifikation der DNA-Vorlage (Template). Die Mutationen führt man hier über zwei zur Zielsequenz komplementäre Vorwärts- und Rückwärts-Primer in das Zielgen ein, das sich auf einem Plasmid befindet. Eine Polymerase mit geringer Fehlerrate (High-Fidelity Polymerase) verlängert die beiden Primer. Sobald sie auf ihrer Runde um das Plasmid am 5‘-Ende des jeweiligen Primers angelangt ist, stoppt die Polymerase, ohne hierbei den Primer zu entfernen.

Anschließend verdaut man das als Template dienende Plasmid mit dem Restriktionsenzym DpnI und schleust die von der Polymerase hergestellte, mutierte ­Kopie, die DpnI nicht zerschneidet, in E. coli Zellen ein. Die Zellen reparieren die noch bestehenden Einkerbungen (Nicks) an den jeweiligen Enden der Primer und replizieren schließlich das Plasmid inklusive des mutierten Gens.

Verschiedene Varianten

Ohne zusätzlichen Restriktionsverdau funktioniert die Overlap-Extension-PCR, die Molekularbiologen seit Ende der achtziger Jahre in verschiedenen Varianten für die zielgerichtete Mutagenese verwenden. In ihrem ursprünglichen Format, das einer verschachtelten PCR ähnelt, benötigt man für die Overlap-Extension-PCR zwei innere, mutierte Primer und zwei äußere, flankierende Primer.

In zwei separaten PCR-Reaktionen stellt man mit diesen zunächst zwei sich überlappende DNA-Fragmente her. Diese enthalten in den sich überschneidenden Sequenzabschnitten an den jeweils gleichen Positionen Mutationen. Anschließend denaturiert man die doppelsträngigen PCR-Produkte, mischt sie und führt nach dem erneuten Anlagern (Annealing) der sich überlappenden Sequenzabschnitte eine PCR mit den beiden äußeren Primern durch.

Je nach Konstruktion der Primer lassen sich mit der Overlap-Extension-PCR auch Insertionen oder Deletionen im Zielgen unterbringen. Verwendet man drei statt vier Primer, wird aus der Overlap-Extension PCR eine Megaprimer-PCR. Bei dieser stellt man in der ersten PCR-Runde mit einem inneren und einem flankierenden Primer zunächst einen Megaprimer her. Diesen setzt man in der zweiten PCR-Runde zusammen mit dem verbliebenen flankierenden Primer ein und erhält schließlich auch auf diesem Weg ein mutiertes DNA-Fragment.

Mit Oligonuklotid-gerichteten Mutagenese-Verfahren manipulieren Molekularbiologen schon seit Jahrzehnten die Genome von Prokaryonten und einfachen Eukaryonten wie der Hefe. Bei komplexer organisierten Genomen von Eukaryonten insbesondere bei Säugerzellen funktioniert das Ganze aber nicht mehr so einfach.

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CRISPR-Cas ist derzeit der Star unter den Nuklease-basierten Editierungs-Techniken. Foto: Berkeley Lab

Hier waren die Forscher bis vor wenigen Jahren noch auf komplizierte, zeitaufwändige und wenig effektive Mutagenese-Protokolle angewiesen. Um zum Beispiel ein Gen in Mäusen auszuschalten oder umzuschreiben (zu editieren), schleuste man ein DNA-Konstrukt, das homologe Sequenzen zum Zielgen aufwies, per Elektroporation in embryonale Stammzellen ein oder überführte es mittels Mikroinjektion direkt in den männlichen Pronucleus befruchteter Eizellen.

Anschließend betete man darum, dass zumindest ein winziger Bruchteil der eingeschleusten DNA-Konstrukte durch homologe Rekombination in die Zielsequenz integriert wurde, bevor man mit der komplizierten Prozedur weiterverfahren konnte. Wenn alles glatt lief, erhielt man nach knapp einem Jahr schließlich eine mutierte Maus.

Viel einfacher und auch deutlich schneller vonstatten geht das Genom-Editieren mit den drei modernen, allesamt auf Nukleasen basierenden Editierungs-Techniken CRISPR-Cas, TALEN sowie ZNF. Insbesondere die von Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier 2012 an der Universität Berkeley in Kalifornien, zunächst für das Editieren von Prokaryonten-Genomen ausgetüftelte CRISPR-Cas Methode erobert die Labors von Biowissenschaftlern derzeit im Sturm. Und nachdem die Gruppen von Rudolph Jänisch und Feng Zhang vom MIT in Boston vor zwei Jahren demonstrierten, dass die Technik auch in Maus und Mensch funktioniert, gibt es für die Forscher kein Halten mehr.

Für den durchschlagenden Erfolg von CRISPR-Cas ist im wesentlichen die Einfachheit des Systems verantwortlich, das aus lediglich zwei Komponenten besteht: der Single Guide RNA (sgRNA), die einen zur Zielsequenz komplementären RNA-Abschnitt aufweist, sowie der Endonuklease Cas9, die von der sgRNA zur Ziel-DNA geleitet wird und in dieser Doppelstrangbrüche (DSBs) verursacht.

Zell-eigener Reparaturdienst

Den restlichen Editierungs-Job erledigt der Säugerzellen-eigene DNA-Reparaturdienst. Dieser hat zwei Optionen. Entweder verarztet er den Bruch, indem er die Enden wieder miteinander verknüpft (Wiederverknüpfung nicht-homologer Enden, NHEJ) oder er bessert die beschädigte Ziel-DNA mit einer neusynthetisierten Kopie aus, die durch homologe Rekombination in den Doppelstrangbruch einfügt wird (Homologie-gerichtete Reparatur, HDR).

Da die NHEJ-Reparatur nie glatt über die Bühne geht, schleichen sich hier meist Insertionen oder Deletionen (Indels) ein, die das Zielgen letztlich ausknocken. Die Homologie-gerichtete Reparatur ist für den Experimentator natürlich eine gemähte Wiese: Um ein Gen zu editieren, muss er lediglich eine passende sgRNA sowie Cas9 in die Zelle einschleusen und dieser gleichzeitig eine frisierte Version des Zielgens unterjubeln.

Simples Prinzip

Dieses simple Editierungs-Prinzip haben Biowissenschaftler inzwischen in nahezu allen Modellorganismen durchexerziert, angefangen bei Hefen, Taufliegen, Zebrafischen, Fröschen, Mäusen, Ratten, bis hin zu verschiedenen Pflanzenmodellen und humanen Zellen.

Mit am meisten von der neuen Technik profitieren dürften aber Biowissenschaftler, die mit Mausmodellen arbeiten. Da man die nötigen CRISPR-Cas Komponenten direkt in Zygoten von Mäusen mikroinjizieren kann, sparen Mausgenetiker das zeitaufwändige Vektordesign und den Umweg über ­embryonale Stammzellen, der bei den bisherigen konventionellen Editierungstechniken nötig war. Die Wartezeit auf die KO-Maus mit dem gewünschten genetischen Background verkürzt sich für die Forscher hierdurch auf etwa sechs Monate.

Wenn man mit CRISPR-Cas auf einfache Weise in die Keimbahn von Mäusen eingreifen kann, ist dies grundsätzlich auch bei Menschen möglich. Viele Wissenschaftler haben sich jedoch für ein generelles Verbot des Keimbahn-Engineerings in Menschen mit CRISPR-Cas ausgesprochen. Dies nicht nur aus ethischen, sondern auch aus rein wissenschaftlichen Gesichtspunkten. Das System arbeitet zwar sehr präzise, dennoch sind Treffer in falschen Genen (Off-Targets) nicht auszuschließen. Problematisch ist auch die hohe Fehlerrate bei der NHEJ-Reparatur und die geringe Effizienz der homologen Rekombination des HDR-Systems. Es ist deshalb weitaus sinnvoller, somatische Zellen als Ziele für gentherapeutische Anwendungen von CRISPR-Cas ins Auge zu fassen.

T-Zell-Editing

Heiße Kandidaten hierfür sind T-Zellen, die zum Beispiel für Immuntherapien gegen Krebs oder bei zellbasierten HIV-Behandlungen eingesetzt werden sollen. Nicht umsonst haben Doudna, Charpentier und Zhang ihr CRISPR-Cas-Knowhow jeweils an verschiedene Start-ups auslizensiert, die unter anderem an T-Zell-basierten Therapien forschen.

Das hierzu nötige Editieren des T-Zell-Genoms, um etwa HIV-Rezeptoren auszuschalten, verlief bisher jedoch zäher als erwartet. Während es bei anderen Zelltypen ausreicht, Cas9 über ein Plasmid zusammen mit der sgRNA einzuschleusen, um das entsprechende Zielgen zu editieren, liegt die Erfolgsquote dieser Methode in T-Zellen nur bei wenigen Prozent.

Wie Kathrin Schuhmann und ihre Kollegen von Jennifer Doudnas und Alexander Marsons Arbeitsgruppe von der Universität Berkely kürzlich demonstrierten, lässt sich die Editierungs-Effizienz aber auch in T-Zellen mit einem relativ simplen Trick deutlich verbessern (PNAS, 112, 10437-42).

Schuhmann stellte hierzu zunächst einen cas9-Ribonukleoprotein-Komplex (RNP) her. Hierzu mischte sie rekombinantes Cas9 und in-vitro-transkribierte sgRNA in einem entsprechenden Puffer im Verhältnis Eins-zu-Eins. Den RNP-Komplex verfrachtete sie anschließend mittels Elektroporation in die T-Zellen. Statt wie bisher in einem bis fünf Prozent der Zellen, löste der Komplex in gut zwanzig Prozent der transformierten T-Zellen die gewünschte Editierung des Zielgens aus.

Offensichtlich geht auch hier der Durchmarsch der CRISPR-Cas-Technik, die derzeit das Mutieren und Editieren von Genen und Genomen revolutioniert, munter weiter.




(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 10/2015, Stand: September 2015, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 30.09.2015


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