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Blitzschnell in die Tiefe
Produktübersicht: Next Generation Sequencing

Bei kaum einer anderen Technik tut sich derzeit soviel wie bei der DNA-Sequenzierung.

Lange Zeit entwickelte sich die DNA-Sequenzierung in einem sehr gemächlichen Tempo. Noch in den späten achtziger Jahren musste man bei der von Sanger 1977 vorgestellten Kettenabbruchmethode mit riesigen, schlabberigen Sequenziergelen hantieren und mühsam Banden auswerten. Erleichterung brachten schließlich die 1990 eingeführten Kapillarelektrophorese-Sequenzierer, die die Sanger-Sequenzierung automatisierten (CE-Sequenzierung). Moderne CE-Sequenzierer erreichen Leseweiten von etwa 1000 Basenpaaren und lesen die DNA-Sequenz sehr präzise. Bis heute gilt ihre Genauigkeit deshalb als Goldstandard. Sie können jedoch nur einen Lesevorgang gleichzeitig ausführen und arbeiten daher sehr langsam.

Zu langsam für den amerikanischen Sequenzier-Spezialisten Jonathan Rothberg, der während seines Vaterschaftsurlaubs 1999 darüber nachdachte, wie er die Sequenzierung beschleunigen könnte. Dabei kam er auf die Idee, Millionen kurzer DNA-Fragmente in den Vertiefungen einer Picotiterplatte mit dem Pyrosequenzierungs-Verfahren parallel zu sequenzieren. Die Pyrosequenzierung fußt auf einer simplen biochemischen Reaktion: jedes mal wenn die Polymerase ein Nukleotid in den Matrizenstrang einbaut, wird ein Pyrophosphat (PPi)-Molekül abgespalten. Das freigewordene PPi setzt nachfolgend eine Luciferase-katalysierte Sekundär-Reaktion in Gang, in deren Verlauf ein Lumineszenz-Signal entsteht.

Massives paralleles Sequenzieren

Das Problem, Millionen von Reaktionsansätzen gleichzeitig ausführen zu müssen, löste Rothberg mit einer auf Kügelchen basierenden Emulsions-PCR (em-PCR). Bei dieser wird jeweils ein einzelnes DNA-Fragment je Kügelchen amplifiziert. Die Kügelchen mit den anhaftenden DNA-Amplikons verteilt man nachfolgend auf einer Picotiterplatte, die so konstruiert ist, dass jeweils nur ein Kügelchen in einem Näpfchen Platz findet. Um die Pyrosequenzierung zu starten, setzt man schließlich die nötigen Reagenzien und eines der vier Nukleotide zu und detektiert die Lichtsignale in den Näpfchen der Picotiterplatte.

Rothberg vermarktete seine Idee des massiven parallelen Sequenzierens (Next Generation Sequencing, NGS) zunächst über die Firma 454 Life Sciences, die er 2004 gründete. Aber schon drei Jahre später schnappte sich Roche, Rothenbergs Firma und gliederte sie in ihr Firmenportfolio ein.

454-Sequenzierer glänzen mit Leseweiten von bis zu 1000 Basen. Die langen Reads erkauft sich der Anwender jedoch sehr teuer. Eine chinesische Gruppe vom Beijing Genome Institut verglich die Kosten verschiedener NGS-Systeme, die pro eine Million Basenpaare (1 MB) entstehen. Bei dem 454 GS FLX-Sequenzierer kam sie auf etwa 10$ (Liu et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, Volume 2012, doi:10.1155/2012/251364). Ähnliche Zahlen findet man auch im „NGS Field Guide“ des amerikanischen Biologen Travis Glenn, (www.molecularecologist.com).

Unterschiedliche Stärken und Schwächen

Wesentlich günstiger sind die Sequenzierkosten pro Mb bei den 454-Konkurrenzsystemen von Illumina (HiSeq, MiSeq-Sequenzierer) und Life Technologies (SOLID-Sequenzierer). Was jedoch nicht automatisch bedeutet, dass diese immer die bessere Wahl sind. So produziert zum Beispiel die Sequenzierung-durch-Ligation-Methode der SOLID-Sequenzierer große Datenmengen (120 Gb pro lauf) und sehr kurze Leseweiten von 50 bis 75 Basen. Mit viel Rechenaufwand müssen diese zu einer sinnvollen DNA-Sequenz zusammengesetzt werden.

Keines der NGS-Flaggschiffe von 454, Illumina, und Life Technologies, das die Chinesen testeten, erreicht im übrigen die Genauigkeit eines „popeligen“ CE-Sequenzierers (ABI 3730xl), die bei etwa 99,999% liegt.

Die Preise für die Spitzengeräte von Roche, Illumina und Life Technologies liegen bei etwa 300.000 bis 500.000 €. Die Geräte in dieser Liga sind im Grunde nur etwas für Sequenzier-Zentren und Sequenzier-Dienstleister. Da dieser Markt recht überschaubar ist, treiben die Hersteller die Entwicklung kostengünstiger, kompakter NGS-Sequenzierer voran.

Hier war es einmal mehr Jonathan Rothberg, der 2010 mit dem Ion Torrent Sequenzierer die Nase vorn hatte. Wie das 454-System basiert auch dieser auf der Pyrosequenzierung mit einer Kügelchen-basierten emPCR als erstem Schritt. Revolutionär neu ist jedoch der weitere Verlauf. Die Myriaden Kügelchen mit klonal amplifizierten DNA-Fragmenten werden in den winzigen, Abermillionen Vertiefungen eines Halbleiterchips immobilisiert. Der Chip ist mit Protonen-sensitivem Tantaloxid beschichtet, das einzelne Protonen registriert, die während der Pyrosequenzierung beim Einbau der Nukleotide in den Matrizenstrang freigesetzt werden.

Im August 2010 nahm Life Technologies Ion Torrent unter seine Fittiche, mit Rothberg als neuem alten Chef. Kurze Zeit später kam die von Rothbergs Team weiterentwickelte Ion Torrent-Variante Ion PGM auf den Markt, die mittlerweile zum Verkaufsschlager avancierte. Am 10. Januar diesen Jahres stellte Life Technologies schließlich mit großem Tam-Tam auf der Konsum-Elektronik-Messe in Las Vegas das Nachfolgemodell Ion Proton vor, das laut Pressemeldung von Life Technologies das gesamte humane Genom an einem Tag zu einem Preis von 1000$­ sequenzieren kann. Tatsache ist jedoch, dass auch Ion Torrent Sequenzierer Schwächen haben. Ihr größtes Manko, das sie mit ihrem 454-Verwandten teilen, sind hohe Fehlerraten bei homopolymeren DNA-Regionen, die zu Insertionen und Deletionen (Indels) führen. Wie sich der Ion PGM-Sequenzierer unter realen Laborbedingungen gegenüber seinen Rivalen von Illumina und Pacific Bioscience schlägt, kann man unter anderem bei Quail et al. nachlesen (BMC Genomics 2012, 13:341).

Nanoporen Sequenzierer

Kaum war der Hype um Life Technologies Ion Proton abgeebbt, da trat im Februar die von dem englischen Membranprotein-Spezialisten Hagan Bayley 2005 mitgegründete Firma Oxford Nanopore Technologies ins Rampenlicht und präsentierte einen Nanoporen-Sequenzierer.

Das Konzept der Nanoporen-Sequenzierung ist nicht neu. Bereits 1996 demonstrierten John Kasianowicz, Eric Brandin, Daniel Branton und David Deamer von der Harvard Universität, dass man einen DNA-Einzelstrang mit der Kraft eines elektrischen Feldes durch einen alpha-Hämolysin-Kanal bugsieren kann.

Auch Oxford Nanopore Technologies nutzt alpha-Hämolysin-Poren in synthetischen Membranen für die Sequenzierung. Schließt man eine Spannung an die Membran an, können Ionen die Hämolysin-Kanäle passieren, woraus ein messbarer Stromfluss resultiert. Auch größere Moleküle, etwa Nukleotide, passen durch den Kanal, blockieren jedoch einen Teil des Ionenflusses und reduzieren die gemessene Stromstärke. Dies nutzt Oxford Nanopore Technologies für zwei unterschiedliche Sequenzierungsstrategien: die Exonuklase Sequenzierung und die Strangsequenzierung. Bei ersterer koppelt man eine Exonuklease an die Hämolysin-Pore, die ein Nukleotid nach dem anderen von dem DNA-Strang abspaltet und in den Kanal schleust. Die einzelnen Nukleotide passieren den Kanal innerhalb weniger Millisekunden und lösen eine charakteristische Änderung des Stromsignals aus. Bei der Strangsequenzierung füttert eine Polymerase die Pore mit einem DNA-Einzelstrang. Dabei interagieren die durch den Kanal hindurch tretenden Basen des DNA-Strangs mit einer spezifischen Domäne des rekombinanten Kanalproteins. Das hierbei entstehende Signal ordnet ein angeschlossener Computer der entsprechenden Base zu.

Es braucht nicht viel Phantasie, um sich vorzustellen, dass bereits wenige tausend Poren genügen, um Millionen Basen in kürzester Zeit zu sequenzieren. Der zweite Trumpf, den die Nanoporen-Sequenzierung ausspielen kann, sind lange Leseweiten. Sequenzdaten von Oxford Nanopore Bioscience zufolge, erreichte ein Prototyp Leseweiten von 5 kB bei einem Durchsatz von 150 Mb in der Stunde. Das hört sich prima an, wäre nicht die hohe Fehlerrate von vier Prozent. Bis zur Markteinführung will die Firma die Fehlerquote jedoch deutlich senken.

Weniger Fehler mit Tags

Ein Grund für die vielen Fehler sind die geringen Unterschiede zwischen den Nukleotiden. Ein interessantes Konzept, wie man dieses Problem lösen könnte, verfolgt das kalifornische Nanoporen-Startup Genia Technologies, das der deutsche Stefan Röver 2009 mitgründete (ja, das ist der gleiche Stefan Röver, der sich auf dem Höhepunkt der Dotcom-Blase an der Pleite seiner Firma Brokat eine goldene Nase verdiente und die Aktionäre gründlich abzockte).

In Zusammenarbeit mit dem amerikanischen NGS-Guru George Church, dem Porenexperten John Kasianowicz und dem Spezialisten für Fluoreszenztags Jingyue Ju will die Firma einen Sequenzierer konstruieren, der auf dem Prinzip der Nanoporen-basierten Sequenzierung-durch-Synthese (NanoSBS) aufbaut.

Die Grundidee ist folgende: Eine am Eingang des Kanals fixierte Polymerase baut ein Nukleotid nach dem anderen in den Einzelstrang ein. Die Nukleotide sind mit jeweils unterschiedlichen Tags versehen, die beim Einbau abgespalten und in die Pore geschleust werden. Da die Tags größere Unterschiede untereinander aufweisen als einzelne Nukleotide, ist auch die Änderung der Stromstärke beim Passieren des Kanals wesentlich größer. Das Gerät sollte sie also genauer auseinander halten können und deutlich weniger Fehler machen. Soweit zumindest der Plan von Genia Technologies, das mit seinem Sequenzierer alle bisherigen Geräte in den Schatten stellen will.




(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2012, Stand: Oktober 2012, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 07.12.2012


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