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„Hallo, hier sind wir!“
Produktübersicht: Protein-Labeling-Kits

In Protein-Labeling-Kits ersetzen immer häufiger organische Farbstoffe die üblichen Fluoreszenzproteine.

Wenn Lebenswissenschaftler beobachten wollen, in welchem Zellkompartiment sich ihr Lieblingsprotein gerade herumtreibt und was es dort anstellt, verpassen sie ihm meist ein leicht zu detektierendes Anhängsel oder Label. Das populärste ist das grünfluoreszierende Protein (GFP), das sich sehr einfach an den N- oder C-Terminus eines Proteins anhängen lässt, indem man das GFP-Gen in den offenen Leserahmen des gewünschten Proteins kloniert. Schleust man dieses Konstrukt in die Zielzelle ein, kann man die Wege des GFP-Fusionsprotein innerhalb der Zelle mit einem Fluoreszenzmikroskop verfolgen. In den letzten Jahren hat die GFP-Familie Zuwachs durch viele Farbvarianten bekommen, die mittlerweile das gesamte Regenbogenspektrum abdecken. Wer will, kann das zu untersuchende Protein mit diesen neuen Familienmitgliedern, die auf Namen hören wie Venus, Emerald, Tomate oder Neptun, regelrecht anmalen.

Mehr Leuchtkraft durch neue Technik
Mit Fluoreszenzproteinen lassen sich Proteine auf simple Weise markieren und meist stört das kleine, kompakte Anhängsel die Wege und die Funktion des gelabelten Proteins innerhalb der Zelle nicht. Dennoch haben GFP und seine Verwandten einige Schwächen. So lässt ihre Leuchtstärke im Vergleich zu organischen Fluoreszenzfarbstoffen genauso zu wünschen übrig wie ihre Photostabilität, und auch die Farbauswahl ist begrenzt. Findige Forscher entwickelten deshalb neue Techniken, mit denen man auch intensiv leuchtende organische Fluorophore gezielt an Proteindomänen anhängen kann. Zwei gängige Beispiele sind die auch in kommerziellen Protein-Labeling-Kits verwendeten AGT- und Dehalogenase-Tags, die die selbst labelnden Eigenschaften der Enzyme O6-Alkylguanin-Transferase (AGT) beziehungsweise Haloalkan-Dehalogenase ausnutzen. Das DNA-Reparaturenzym AGT erkennt O6-alkylierte Guaninbasen und überträgt die Alkyl-Gruppe auf einen Cystein-Rest des Enzyms. Kai Johnssons Gruppe am EPFL in Lausanne kam Anfang des neuen Milleniums auf die Idee, diese Autoalkylierung für das Labeln von Proteinen zu nutzen. Dazu stellt man zunächst ein Fusionsprotein aus AGT und dem zu labelnden Protein her und exprimiert es in Säugerzellen. Diesen setzt man anschließend ein O6-Benzylguanin-Derivat als Substrat zu, das mit einem Fluorophor, Biotin, einem Hapten oder einem sonstigen leicht detektierbaren Liganden versehen ist. AGT überträgt das markierte Benzylmolekül auf einen eigenen Cystein-Rest und labelt so das AGT-Fusionsprotein. Inzwischen ist eine weitere AGT-Variante erhältlich, die sich beim Alkyltransfer auf O6-Benzylcytosin-Substrate spezialisiert hat. Kombiniert man die beiden AGT-Enzyme, kann man in einer Zelle zwei Proteine mit unterschiedlichen Fluoreszenz-Tags gleichzeitig markieren.

Labeling-Kits, die auf Dehalogenase-Tags basieren, funktionieren nach einem ähnlichen Prinzip. Auch hier konstruiert man zunächst ein Fusionsprotein aus Haloalkan-Dehalogenase und dem zu labelnden Protein. Hierbei verwendet man aber nicht das native Enzym, das Halogenide von halogenierten Kohlenwasserstoffen entfernt und die im Verlauf der Reaktion gebildete Esterbindung zwischen Kohlenwasserstoff und reaktiven Gruppe wieder hydrolysiert. Stattdessen benutzt man eine rekombinante Enzymvariante mit fehlender Esterhydrolyse, bei der die mit einem Fluorophor markierte Kohlenwasserstoff-Kette kovalent über die Esterbindung mit dem Enzym verbunden bleibt.

Produktübersicht
Das waren noch Zeiten, als es die drei alten Kämpen der deutschen Organischen Chemie Hermann Staudinger, Georg Wittig und Rolf Huisgen (v.l.) bei ihren Versuchen noch so richtig krachen ließen. Staudinger verlagerte seine (gescheiterten) Diamanten-Synthese-Versuche schon mal in den Steinbruch, damit er nicht sein Labor pulverisierte.



Fluoreszenz-Blitz

Sowohl AGT als auch Haloalkan-Dehalogenase sind zwar kleine Proteine, dennoch können sie in ungünstigen Fällen die Struktur und Funktion des gelabelten Proteins stören. Dieses Risiko kann man mit dem Ende der neunziger Jahre im Labor des GFP-Papstes und Nobelpreisträgers Roger Tsien kreierten Tetracystein-Biarsen-Labeling-System nahezu ausschließen. Bei dieser auch als Flash-Labeling bezeichneten Methode, kloniert man eine kurze Peptidsequenz aus sechs Aminosäuren – zwei beliebigen in der Mitte flankiert von zwei Cysteinen an den Enden – in die Sequenz des Zielproteins. Das Konstrukt exprimiert man in der gewünschten Zelle und setzt den zellpermeablen, biarsenischen Farbstoff Flash-EDT2 zu. Dieser bindet über seine Arsen-Atome an die Cystein-Reste der Peptidsequenz und bildet mit dieser einen fluoreszierenden Komplex. Zwar wissen Farbstoffchemiker bis heute nicht so recht, warum Flash-EDT2 nur fluoresziert, wenn es an die CCXXCC-Aminosäuresequenz gebunden ist. Biologen dürfte dies aber ziemlich wurscht sein, solange ihr Flash-gelabeltes Lieblingsprotein sattgrün in den Zellen fluoresziert.

Bioorthogonal

Tsiens Tetracystein-Biarsen-Reaktion läutete ganz nebenbei auch das Zeitalter der bioorthogonalen Reaktionen ein. Bei diesen reagieren zwei funktionelle abiotische Gruppen innerhalb einer Zelle absolut spezifisch nur miteinander und nicht mit anderen biologischen Komponenten. Der Prototyp einer bioorthogonalen Reaktion ist die von Carolyn Bertozzi im kalifornischen Berkely entwickelte Staudinger-Ligation. Diese basiert auf der Reaktion eines Azids mit einem Triphenyl-Phosphan zu einem Amin (Staudinger-Reaktion), die der in der Mitte des letzten Jahrhunderts in Freiburg lehrende Chemie-Nobelpreisträger Hermann Staudinger bereits 1919 entdeckte.

Die Staudinger-Ligation ist verblüffend simpel: Das zu labelnde Protein (oder sonstige Biomolekül) verknüpft man zunächst mit einer Azid-Gruppe, um es anschließend in der Zelle mit einem Fluoreszenz-markierten Triarylphosphan-Derivat reagieren zu lassen. Unter Abspaltung von Stickstoff bindet letzteres schließlich über eine Amid-Bindung an das zu labelnde Protein.

Für Furore in der Biologie sorgt derzeit auch die unter Organischen Chemikern altbekannte kupferkatalysierte Cycloaddition von Aziden an Alkine, die ebenfalls zu den bioorthogonalen Reaktionen zählt. Diese auch als CuAAC bezeichnete Reaktion, die der deutsche Pionier der Cycloaddition, Rolf Huisgen bereits in den 1950er Jahren analysierte und die sein amerikanischer Kollege Barry Sharpless vom Scripps Research Institut durch die Katalyse mit Kupferionen nachfolgend optimierte, ist die klassische Reaktion der so genannten Click-Chemie.

Es hat zwar etwas länger gedauert, bis es auch bei den Biologen click gemacht hat, inzwischen findet man Click-Chemie-Reaktionen aber auch in Protein-Labeling-Kits. Das größte Hindernis waren bisher die Kupferionen, die bei höheren Konzentration für die meisten Zellen toxisch sind. Eine Lösung dieses Problems fand Carolyn Bertozzi in der Bibliothek von Berkeley, als sie die gut 50 Jahre alten, auf Deutsch geschriebenen Originalarbeiten des Staudinger-Schülers und Nobelpreisträgers Georg Wittig zur Cycloaddition von Aziden an Cycloalkine durch­ackerte. Das muss man sich wirklich auf der Zunge zergehen lassen: eine amerikanische Biowissenschaftlerin kämpft sich in den Katakomben einer kalifornischen Edelschmiede durch die staubtrockenen, in deutsch abgefassten Aufzeichnungen des Hardcore-Organikers und Grundlagenforschers Georg Wittig aus den sechziger Jahren und zieht daraus Erkenntnisse für eine topmoderne biologische Methode.

Ihr fiel auf, dass Wittig in seiner Veröffentlichung von einer explosionsartigen Reaktion des cyclischen Alkins Cyclooktin mit der Azid-Gruppe berichtete. Offensichtlich reagierte Cyclooktin durch die Ringspannung auch ohne Cu-Katalyse ziemlich flott mit der Azid-Gruppe. Von dieser Erkenntnis bis zum Markieren des Cyclooktins mit Biotin und dessen Reaktion in einer Zellkultur mit einem Azid-verknüpften Biomolekül war es für Bertozzi nur noch ein kleiner Schritt.




(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 09/2012, Stand: August 2012, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 07.10.2012


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