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Kleine Welt ganz groß
Produktübersicht: Mikroskope

DNA-IsolierungRobert Hookes zusammengesetztes Auflicht-Mikroskop, das er für die Anfertigung seiner Zeichnungen in Micrographia benutzte.

Bereits im 17. Jhr. stellte Robert Hooke in seinem Buch „Micrographia“ ein mehrlinsiges Mikroskop vor. Bis heute ist das Mikroskop eines der wichtigsten Arbeitsgeräte im Labor geblieben.

Schon die Linsenschleifer und Optiker der frühen Mikroskopmanufakturen versuchten die Auflösung ihrer Mikroskope kontinuierlich zu verbessern. Aber bereits 1870 erklärte ihnen der Jenaer Optiker und Pionier des modernen Mikroskops, Ernst Abbe, dass die Auflösung eines Lichtmikroskops nicht höher sein kann als die halbe Wellenlänge des sichtbaren Lichts. Da diese zwischen 450 und 700 Nanometern liegt, befindet sich die Auflösungs- oder Diffraktionsgrenze bei etwa 200 Nanometern in der optischen Ebene (laterale Auflösung) und 450 Nanometern entlang der optischen Achse (axiale Auflösung). Hieraus folgt, dass man zwei Punkte, die näher als 200 Nanometer zusammen liegen, mit dem Lichtmikroskop nicht mehr auseinanderhalten kann.

Selbst mit perfekt geschliffenen Linsen, optimalen Strahlengängen und großen Öffnungswinkeln der Objektive (hohe numerische Apertur), lässt sich die Diffraktionsgrenze nicht überwinden. Umgehen kann man sie aber durchaus, und in den letzten Jahren haben clevere Mikroskopbauer verschiedene Techniken entwickelt, mit denen man auch hinter die Auflösungsgrenze blicken kann.


Begrenzte Auflösung

Die ersten Mikroskope, die bis an die Auflösungsbarriere heranreichten und noch vor wenigen Jahren als die höchstauf­lösenden Mikroskope galten, waren Konfokale Laser Scanning Mikroskope (CLSM). Bei diesen tastet ein fokussierter Laserstrahl die fluoreszenzmarkierte Probe in kleinen Schritten ab. Das Licht, das die Probe nach Anregung durch den Laserstrahl aussendet, wird von einer Optik durch die winzige Öffnung einer Lochblende geleitet und fällt schließlich auf die lichtempfindlichen Zellen eines Photomultipliers, die das optische Signal in ein elektrisches umwandeln. Die Recheneinheit des Mikroskops ordnet die emittierten Lichtstrahlen den jeweiligen Positionen des Laserstrahls zu und erzeugt daraus ein Bild der gescannten Probe.

Will man mit dem CLSM möglichst nah an die Auflösungsgrenze herankommen oder sie sogar überwinden, muss man die Öffnung der Lochblende so eng wie möglich einstellen. Dies hat jedoch zur Folge, dass immer weniger Licht an dem Photomultiplier ankommt. Auch im CLSM stoßen deshalb sowohl die laterale, als auch die axiale Auflösung an ihre Grenzen und sind in der Regel nicht besser als 180 beziehungsweise 500 Nanometer.


Im Wohnzimmer zusammengebastelt

Dem amerikanischen Physiker Eric Betzig, der mittlerweile am Janelia Farm Research Campus des Howard Hughes Medical Institut eine Gruppe leitet, war diese Auflösung entschieden zu schlecht. Bereits Anfang der neunziger Jahre hatte er in den Bell-Laboratorien ein Nahfeld Mikroskop mitentwickelt, das Oberflächenstrukturen mit einer Auflösung von 20 Nanometern darstellen kann. Dass dieses SNOM-Mikroskop nur für die Analyse von Oberflächen zu gebrauchen war, wurmte Betzig aber offensichtlich sehr. Er verließ die Bell-Laboratorien, stieg komplett aus der Forschung aus und arbeitete sechs Jahre lang, bis 2002, in der Maschinenfabrik seines Vaters als Konstrukteur.

In seinem Kopf spukte aber immer noch die Idee eines superauflösenden Mikroskops umher, mit dem man die Diffraktionsbarriere nicht nur an der Oberfläche, sondern auch im Inneren von Zellen überwinden konnte. Schließlich schmiss er auch den Job bei seinem Vater und tüftelte zwei Jahre an der Theorie seines neuartigen Mikroskops. 2005 war er soweit und schraubte gemeinsam mit seinem Kumpel Harald Hess aus alten Bell-Labor-Zeiten, der wie Betzig ohne eine anständige (wissenschaftliche) Arbeit war, in dessen Wohnzimmer den ersten Prototypen des superauflösenden Mikroskops zusammen.

Das neuartige Mikroskopie-Verfahren, das Hess und Betzig Photo-Activation Localization Microscopy, kurz PALM nannten, basiert auf der simultanen Anregung von fluoreszierenden Einzelmolekülen (Proteinen), die durch Photoaktivierung an- und ausgeschaltet werden. Durch wiederholtes aktivieren definierter Molekül-Gruppen erzeugt das Mikroskop eine Karte mit den exakten Positionen der aufblitzenden Moleküle, die eine angeschlossene Recheneinheit in ein hochaufgelöstes Bild umwandelt. PALM-Mikroskope und die nach dem gleichen Prinzip funktionierenden STORM-Mikroskope, die beide inzwischen auch kommerziell erhältlich sind, erreichen eine laterale Auflösung von 20 bis 50 Nanometern und eine axiale Auflösung von 20 bis 100 Nanometern.

Auch bei Stefan Hell, einem weiteren Protagonisten des aktuellen Booms bei den superauflösenden Mikroskopen, verlief der Weg von der Idee bis zum funktionierenden Mikroskop alles andere als geradlinig. Den theoretischen Hintergrund seines STED-Mikroskopes, STED steht für Stimulated Emmision Depletion, präsentierte Hell bereits 1994 in Optical Letters. Geglaubt, dass Hells STED-Prinzip auch in der Realität funktioniert hat damals in der Fachwelt aber so gut wie niemand. Um ein Haar wäre Hell, der genauso konsequent wie Betzig und die Urahnen der Mikroskopie Hooke und Leeuwenhoek an seinen „verrückten“ Ideen festhielt, aus dem Wissenschaftsbetrieb aussortiert worden. Selbst als er 1999 das erste STED-Mikroskop vorstellte, erkannten nur wenige Insider, welche Revolution sich in der Mikroskopie anbahnte.

Wie die PALM-Methode fußt auch die STED-Mikroskopie auf dem schnellen An- und Ausschalten von fluoreszenzmarkierten Molekülen beziehungsweise Proteinen. Im Gegensatz zum PALM-Verfahren werden bei STED aber nicht einzelne fluoreszierende Moleküle mit Laserstrahlen an- und abgeregt sondern ganze Molekülensembles. Ein fokussierter Laserstrahl, der die Fluoreszenz anregt wird hierbei von einem Unterlegscheiben-förmigen Löschstrahl (mit einem Loch in der Mitte) überlagert. Da der hieraus resultierende, von dem Mikroskop detektierte Fluoreszenz-Punkt nur einen Durchmesser von etwa 20 Nanometern aufweist, sind mit dem STED-Mikroskop laterale Auflösungen von 20 bis 100 Nanometern möglich. Nachdem Hell die Fachwelt doch noch von dem Potential seines Mikroskops überzeugen konnte, wird auch das STED-Mikroskop inzwischen von einem großen Hersteller in Serie gebaut.


Lichtscheibe

Von Ernst Stelzers Gruppe am EMBL in Heidelberg stammt die Vorlage für das Lichtscheiben, oder SPIM-Mikroskop, das derzeit noch die Produktentwicklungsphase bei einem Mikroskophersteller durchläuft und in absehbarer Zeit zu kaufen sein wird. Die technischen Details des SPIM-Mikroskops sind ähnlich kompliziert wie die der superauflösenden Mikroskope. Das Grundprinzip des von Stelzer und seinem Mitarbeiter Jan Huisken konstruierten Geräts leuchtet aber auch Biologen ein. Statt parallel zur Beobachtungsrichtung, wie bei einem konfokalen Mikroskop, fällt das Beleuchtungslicht beim SPIM-Mikroskop von der Seite auf die Probe und besteht nicht aus einem fokussierten Laserstrahl, sondern aus einer Lichtscheibe. Eine CCD-Kamera detektiert die nach der Anregung senkrecht zur Beleuchtungs-Richtung emittierte Fluoreszenz und erzeugt daraus ein Bild. Dreht man die Probe schrittweise um ihre Achse, so kann man Schichtbilder aufzeichnen, die verschiedene Ansichten des Objekt zeigen. Hierdurch sinkt nicht nur die Strahlenbelastung für die Probe. Es werden auch Regionen sichtbar, die im klassischen Konfokalen Fluoreszenzmikroskop verdeckt bleiben und man kann dreidimensionale Bilder von lebenden Objekten aufnehmen. Stelzers Gruppe setzt das SPIM-Mikroskop bei der Analyse von dreidimensionalen Zellkulturen ein und sieht darin eine der vielversprechendsten SPIM-Anwendungen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2011, Stand: November 2011, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 30.12.2011


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