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Zellzerstäuber mit Lasershow
Produktübersicht: Durchflusszytometer

Nozzle
An der Ausgangsdüse (Nozzle) moderner Durchflusszytometer sorgen meist mehrere Laser gleichzeitig für die Anregung der im Flüssigkeitsstrom vorbeifliegenden fluoreszenzmarkierten Zellen.

Mit modernen Durchflusszytometern kann man ein gutes Dutzend Zellparameter gleichzeitig analysieren. Das dürfte aber noch lange nicht das Ende der Fahnenstange sein.

1934 veröffentlichte das Wissenschaftsmagazin Science ein bemerkenswertes Paper des kanadischen Bakteriologen Andrew Moldavan in der Rubrik „Scientific Aparatus and Laboratory Methods“. Die Publikation von Moldavan, der zur damaligen Zeit im Labor der Montrealer Molkerei „Guaranteed Pure Milk“ die angelieferte Milch auf mikrobiologische Verunreinigungen untersuchte, war kaum länger als das Abstrakt eines üblichen Papers und beschrieb nur eine vage Idee – allerdings eine brilliante. Moldovan schlug vor, dass man Zellen vereinzeln und zählen könnte, wenn man sie in einer wässrigen Zellsuspension durch eine feine Glaskapillare presst, die in der Objektebene eines Mikroskopes angebracht ist. Die im Gänsemarsch durch die Kapillare wandernden Zellen wollte Moldavan mit einer photoelektrischen, an das Okular angeschlossenen Apparatur registrieren, die bei jeder Zelle ein elektrisches Signal auslöst, das sich verstärken und aufzeichnen ließ.

In wenigen, dürren Sätzen, die kaum eine halbe Seite in Science füllten, hatte der Milchbakteriologe Moldavan damit das Grundprinzip eines Durchflusszytometers skizziert. Gebaut hat er das Gerät aber nie. Seine Idee verstaubte vielmehr in den Bibliothekskatakomben, und er selbst zählte die E. coli-Zellen in der Milch weiterhin mit den damals üblichen zeitaufwändigen Methoden. Erst 20 Jahre nach Moldavan stellte Wallace Coulter schließlich den ersten labortauglichen Durchflusszytometer vor, mit dem Mediziner Blutzellen zählen konnten. Der „Coulter Counter“ registrierte die Zellen jedoch nicht über ein optisches und photoelektrisches System sondern durch Leitfähigkeitsänderungen (elektrische Impedanz), die die Zellen verursachten, wenn sie die Messeinheit passierten.


Durchflusszytometer-Pioniere

Wesentlich näher dran an Moldavans Grundidee waren dann Ende der 60 Jahre die beiden Väter der modernen Durchflusszytometrie, Leonard Herzenberg und Wolfgang Göhde. Letzterer entwickelte an der Universität Münster das erste Fluoreszenz-Durchflusszytometer, das fluoreszenzmarkierte Zellen registrierte, wenn sie in einem Flüssigkeitsstrom an der Messzelle vorbeirauschten. So wie es bereits Moldavan vorschwebte, leitete Göhde das Fluoreszenz-Signal über ein optisches System auf einen Photomultiplier, der es elektrisch verstärkte und an eine Auswerteinheit weitergab. Fast zeitgleich mit Göhde arbeitete Leonard Herzenberg in Stanford an einem ähnlichen funktionierenden Fluoreszenz-Durchflusszytometer. Herzenberg erweiterte dieses jedoch um ein Sortiersystem, mit dem er die markierten Zellen oder einzelne Subpopulationen davon auffangen konnte, nachdem sie die Messeinheit passiert hatten. Herzenbergs Fluoreszensaktiviertes Zellsortierungs-Durchflusszytometer, kurz FACS, kam schließlich Mitte der siebziger Jahre auf den Markt.


Laserlicht satt

Auf diesen beiden, von Göhde und Herzenberg erdachten Prototypen basieren praktisch alle modernen Durchflusszytomer. Statt einer Quecksilberdampf-Hochdrucklampe, wie in Göhdes historischem Gerät, sind in diesen jedoch ganze Batterien von Lasern installiert, die mit verschiedenen Wellenlängen auf die vorbeifliegenden fluoreszenzgelabelten Zellen zielen. Schon Standard-Durchflusszytometer für Routineuntersuchungen, etwa in der Hämatologie, sind mit zwei oder drei Lasern ausgerüstet, in High End-Geräten sorgen bis zu sieben Laserstrahlen für die nötige Fluoreszenz-Anregung.

Möglichst viele Laser sind für die insbesondere unter Immunologen immer populärer werdenden Mehrfarbenfluoreszenz- beziehungsweise Multiparameter-Analysen auch von Nöten. Bei diesen markiert man die Zellen mit verschiedenen Fluoreszenz-Antikörpern, die gegen ausgesuchte Antigene, etwa Oberflächenrezeptoren, Enzyme, intrazelluläre Marker oder Zellorganellen, gerichtet sind. Wenn man die Fluoreszenz-Antikörper geschickt zusammenstellt – ihre Emissionspektren sollten sich möglichst wenig überlappen – kann man bereits mit einem Drei-Laser-Durchflusszytometer zehn Zell-Parameter gleichzeitig analysieren. Spitzenreiter bei der Mehrfarbenanalyse sind derzeit Sieben-Laser-Geräte, die fast 50 „Farben“ unterscheiden können.


Massen-Zytometer

In der Praxis ist die gleichzeitige Analyse von mehr als zehn Parametern jedoch eine knifflige Angelegenheit. Mit jedem zusätzlichen Fluoreszenz-Antikörper wird es schwieriger, Überlagerungen der Emissionsspektren zu verhindern und in falschen Kanälen landende Fluoreszenz-Signale mit entsprechenden Softwareprogrammen auszugleichen.

Scott Tanners Gruppe an der Universität Toronto hat deshalb ein so genanntes Massen-Zytometer namens Cytof entwickelt und 2009 in einem Analytical Biochemistry Paper der Wissenschaftsgemeinde vorgestellt. Bei diesen haben die Forscher das Funktionsprinzip eines Durchflusszytometers auf ein Time of Flight (TOF)-Massenspektrometer übertragen. Statt mit Fluoreszenz-Antikörpern markiert man die Zellen bei einem Cytof-Experiment mit Antikörpern, die an Übergangsmetall-Isotope gekoppelt sind, die in der Natur nicht vorkommen. Die Isotop-markierten Zellen sprüht man als einzelne Tropfen in ein mehr als 5.000 °C heißes Argonplasma, in dem die Zelltropfen sofort verdampfen und die darin enthaltenen Atome und Moleküle ionisiert werden. Die Ionen fliegen daraufhin durch das Flugrohr eines TOF-Massenspektrometers, an dessen Ende sie mit den in der Massenspektrometrie üblichen Verfahren detektiert und analysiert werden.


Hundert Zellparameter auf einen Schlag

Weil sich die Isotope in dem Cytof-Gerät, im Gegensatz zu den sich überlagernden Emissionsspektren in klassischen Durchflusszytometern, nicht ins Gehege kommen, lassen sich mit dem Cytof dutzende Zellparameter gleichzeitig analysieren. So beschreibt zum Beispiel ein Team um den amerikanischen Stammzellforscher Garry Nolan von der Stanford Unversität und dem Cytof-Entwickler Tanner in einer im Mai erschienen Publikation, wie es mit einem Cytof-Prototypen 34 Zellparameter (31 Proteine, Zellviabilität, DNA Gehalt und Zellgröße) in menschlichen Knochenmarkszellen gleichzeitig gemessen hat (S. Bendall et al., Science Vol 332, 687-95). Die Autoren schätzen, dass man mit dem Cytof künftig sogar bis zu 100 Zellparameter parallel untersuchen kann.

Wer ausprobieren will, ob diese Prognose tatsächlich zutrifft, kann ein Cytof-Gerät bei der von Tanner mittlerweile gegründeten Firma DVS Sciences bestellen. Den Verkaufspreis des Gerätes konnte der LJ-Redakteur leider nicht in Erfahrung bringen, aber aus der Portokasse wird man es sicher nicht bezahlen können.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 07/2011, Stand: Juni 2011, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 27.07.2011


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