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Phosphat-Transfer
Produktübersicht: Kinase Assays

Element
In vielen Kinase Assays enthalten: das Lanthanoid Terbium.

Was haben Handys und Kinase-Assays gemeinsam? In beiden stecken häufig Metalle der Seltenen Erden.

Proteinkinasen übertragen die γ-Phosphatgruppe von ATP auf Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Seitenketten von Proteinen oder Peptiden und erzeugen so Phosphoproteine und ADP.

Um die Aktivität einer Proteinkinase zu bestimmen, muss man also entweder die Abnahme der ATP-Konzentration oder die Zunahme von Phosphoproteinen beziehungsweise ADP messen. Auf diesem simplen Prinzip beruhen denn auch die allermeisten kommerziellen Kinase-Assays, die sich grob in die drei Kategorien Phosphoprotein-, ATP- oder ADP-Konzentrationstest einteilen lassen.

Dass man bei Kinase-Assays im Grunde immer nur einen dieser drei Parameter misst, bedeutet aber nicht, dass alle Assays gleich ablaufen, ganz im Gegenteil. Allein für die zur Kategorie eins zählenden Kinase-Assays (Phosphoprotein-Konzentrationstest) haben sich die Assay-Entwickler mittlerweile ein gutes Dutzend raffinierter Detektionsmethoden ausgedacht, die auf unterschiedlichen physikalischen Phänomenen beruhen.


Präzise, aber radioaktiv

Die klassische, und nach wie vor eine der genauesten Methoden, um phosphorylierte Proteine beziehungsweise die Kinaseaktivität nachzuweisen und zu quantifizieren, ist der radiometrische Filterbindungs-Assay. Hier führt man die Kinasereaktion in Gegenwart von 32P-γ-ATP oder 33P-γ-ATP durch, bindet die radioaktiv markierten Phosphoproteine auf einem Nitrocellulose-Filter, trocknet diesen und misst die Radioaktivität auf dem Filter mit einem Szintillationszähler. Der Filterbindungs-Assay liefert sehr präzise Ergebnisse und ist für alle Kinasen und deren Substrate universell einsetzbar. Für Hochdurchsatzanalysen ist er aber kaum zu gebrauchen.

Dazu sind so genannte Szintillations-Proximitäts-Assays (SPA) besser geeignet. Statt auf einem Filterpapier hält man bei diesen die 33P-markierten und meist biotinylierten Phosphoproteine oder Peptide auf Mikroperlen (Beads) fest, die mit einer Szintillations-Substanz und Streptavidin beschichtet sind. Die bei der Bindung an die Beads ausgesandten Lichtsignale wertet eine CCD-Kamera aus.


Fluorophor-Bremse

Wer ganz auf radioaktive Kinase-Assays verzichten will, kann aus verschiedenen Fluoreszenz-Assays auswählen, die auf der Fluoreszenzpolarisation (FP) oder dem Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basieren.

Bei FP-Kinase-Assays setzt man große Moleküle als Bremsklötze für Fluorophore ein, die durch polarisiertes Licht zur Rotation angeregt wurden. Sobald die Moleküle an den Fluorophor binden, rotiert dieser langsamer und sein Fluoreszenzpolarisations-Signal verstärkt sich. Dazu markiert man Peptide zunächst mit einer fluoreszierenden Gruppe und setzt sie als Substrate für die Kinase ein. Metallchelat-Beads, die mit der Phosphatgruppe wechselwirken, fangen die fluoreszierenden Phosphopeptide im nächsten Schritt ein. Durch den damit verbundenen Bremseffekt ändert sich das Fluoreszenzpolarisations-Signal, über das sich die Kinseaktivität ermitteln lässt.

Beim Förster-Resonanzenergietransfer überträgt ein Donor-Fluorophor seine nach Fluoreszenz-Anregung aufgenommene Energie strahlunglos auf einen benachbarten Akzeptor-Fluorophor, der daraufhin fluoresziert. Der Trick ist, Donor und Akzeptor nur unter definierten Bedingungen so weit näher kommen zu lassen, dass der Energietransfer stattfinden kann.

Meist dienen Metalle der Seltenen Erden wie Terbium und Europium als Fluoreszenz-Donoren. An letztere koppeln die Kit-Hersteller häufig Anti-Phospho-Antikörper. Im ersten Schritt dieser Assays phosphoryliert die Kinase ein mit Fluorescein gelabeltes Peptid. Nachfolgend setzt man mit Anti-Phospho-Antikörpern markiertes Terbium zu. Der Antikörper schnappt sich die Phosphatgruppe und rückt das phosphorylierte und mit Fluorescein gelabelte Peptid so weit in die Nähe des Fluoreszenz-Donors Terbium, dass der Förster-Resonanzenergietransfer ablaufen kann. Je mehr Phospho-Peptide an die Terbium-gelabelten Antikörper binden, desto stärker das FRET-Signal, das letztlich die Messgröße für die Kinaseaktivität liefert.


Über fünf Ecken

Kinase-Assays, die die Kinaseaktivität über die Abnahme der ATP-Konzentration messen, enthalten meist alle nötigen Ingridienzien für eine Luciferase-Reaktion. Bei dieser reagiert Luciferin mit ATP zu Luciferyl-Adenylat, das wiederum mit Sauerstoff zu Oxyluciferin, AMP und Licht weiterreagiert. Je stärker die Kinaseaktivität, desto weniger ATP verbleibt für die Luciferase- Reaktion und desto schummriger leuchtet das Lumineszenz-Signal. Umgekehrt führt eine geringe Kinaseaktivität zu einer starken Lumineszenz.

Auch die Zunahme von ADP während der Kinasereaktion lässt sich mit der Fluo­reszenzpolarisation ermitteln. Bei diesen Kinase-Assays bindet mit Terbium oder Europium gelabeltes ADP an einen Anti-ADP-Antikörper woraus ein starkes Fluoreszenzpolarisations-Signal resultiert. Das während der Kinasereaktion frei werdende ADP konkurriert mit dem Tb- oder Eu-gelabelten ADP um die Bindung an den Antikörper und schwächt so die Fluoreszenpolarisation, die letztlich Aufschluss über die Kinaseaktivität gibt.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2010, Stand: November 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 15.12.2010


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