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Produktübersicht: Nukleinsäure-Labeling-Kits

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Wer Nukleinsäuren mit einem Label versehen will, kann dazu verschiedene Methoden verwenden. Zu traditionellen Verfahren haben sich inzwischen auch neue Konzepte gesellt.

Ein typisches Geräusch aus dem Labor, an das sich der Schreiber dieser Zeilen noch gut erinnern kann, ist das Knacken des Geigerzählers. Es begleitete den LJ-Redakteur regelmäßig, wenn er DNA-Sonden für Northern-Blots mit 32P-dCTP markierte und dazu den Arbeitsplatz im Isotopenlabor mit dem kleinen gelben Blechkasten überprüfte. Führte man den Geigerzähler auch nur in die Nähe der radioaktiv markierten DNA-Sonde schwoll das leise Ticken zu einem infernalischen Knattern an, das nicht sonderlich beruhigend klang.

Den Umgang mit dem beta-Strahler 32P muss sich heute niemand mehr antun, wenn er Nukleinsäuren markieren will, mittlerweile haben Nukleinsäure-Labeling-Kits, die auf Fluoreszenz- oder anderen Farbstoffen basieren, radioaktives 32P-dCTP abgelöst.

Eine der ersten nichtradioaktiven Labeling-Methoden war die Markierung von Nukleinsäuren mit dem Fingerhut-Steroid Digoxigenin (DIG). Das DIG-Label lässt sich mit verschiedenen Methoden in DNA-Sonden einbauen, ein Klassiker ist die vor beinahe 30 Jahren von Andrew P. Feinberg und Bert Vogelstein ersonnene Random-Primed-Labeling-Methode. Bei dieser synthetisiert das Klenow-Enzym den komplementären Strang der denaturierten DNA-Probe und benutzt dazu Hexanukleotide (bei manchen modernen Varianten auch Dekanukleotide) mit zufälligen Sequenzen als Primer. Das Enzym verlängert diese mit einer zugegebenen Mischung aus Desoxyribonukleotiden, die unter anderem auch DIG-markiertes dUTP enthält und baut so DIG-dUTP in den DNA-Strang ein. Ein anti-DIG-Antikörper, der an eine alkalische Phosphatase gekoppelt ist, bindet im nächsten Schritt an die DIG-dUTP-markierte DNA-Sonde und eine von der alkalischen Phosphatase katalysierte Farb- oder Lumineszenzreaktion zeigt schließlich die Hybridisierung der Sonde mit einer komplementären Sequenz an.

Die Random-Primed-Labeling-Methode hat zwar auch im Zeitalter der PCR noch nicht ausgedient, die PCR drängt sich für das Labeln von Nukleinsäuren aber geradezu auf. Bei PCR-basierten DIG-Labeling­Kits pipettiert man einfach neben dATP, dCTP, dGTP und dTTP zusätzlich Digoxigenin-11-dUTP in den PCR-Ansatz und isoliert anschließend das DIG-gelabelte Amplikon.


Wie Kletten

Als Alternative zu Digoxigenin und anti-DIG-Antikörper finden sich in vielen Kits die Moleküle Biotin und Streptavidin, die wie Kletten aneinander haften, sobald sie aufeinander treffen. Ähnlich wie bei der DIG-dUTP-Methode integriert man zunächst dCTP-Biotin via PCR oder Random-Primer-Labeling in das gewünschte Nukleinsäurefragment und setzt anschließend mit alkalischer Phosphatase gekoppeltes Streptavidin zu. Weil die Bindung von dCTP-Biotin an Streptavidin deutlich stärker ist als die des Pärchens Digoxigenin anti-DIG-Antikörper, kann man die Reaktions-Ansätze gründlicher waschen. Nach Aussage der Kit-Hersteller ist die Biotin-Labeling-Methode deshalb etwas empfindlicher als die DIG-Labeling-Methode.

Noch einfacher als die indirekten Labeling-Verfahren mit Digoxigenin, Biotin oder Amin-modifizierten Nukleotiden funktionieren direkte Labeling Methoden, bei denen ein fluoreszenzmarkiertes Nukleotid, etwa dUTP, durch eine PCR-Reaktion in die DNA-Sequenz integriert wird. Die Farbpalette dieser PCR Labeling Kits lässt inzwischen keine Wünsche mehr offen und enthält alle erdenklichen Fluo­reszenzlabel, angefangen bei verschiedenen Atto-Farbstoffen über Cy3 und Cy5 bis hin zu Texas Red.

Eine völlig andere Strategie verfolgt ein neues Labeling-Verfahren, das auf der von dem amerikanischen Nobelpreisträger Barry Sharpless entwickelten Cu(I)-katalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) basiert, die seit einigen Jahren in der organischen Chemie für Furore sorgt. Diese auch Cu(I)-katalysierte „Click“-Huisgen-Cyclysierung genannte Reak­tion ist ein klassisches Beispiel dafür, wie eine lange Zeit nur unter Organik-Freaks bekannte Reaktion plötzlich den Weg in die Biologielabore findet. Sie verdeutlicht aber auch, dass man als Student nie weiß, für was man das Gelernte letztendlich gebrauchen kann. So musste sich der LJ-Redakteur während seines Chemie-Studiums (mit Schwerpunkt Biochemie) quälend lange mit allen möglichen Varianten von Cycloadditionen herumschlagen, die ihm einer der Granden der deutschen Organik, der Freiburger Horst Prinzbach, in seinen Vorlesungen nahe zu bringen versuchte. Mehr als einmal fragte sich der LJ-Redakteur dabei verzweifelt, was er mit den teils abstrusen Cycloadditionen jemals anfangen sollte, die Horst Prinzbach unerbittlich an die Tafel malte.

CuAAC-Reaktionen sind aber gar nicht so kompliziert, wie ihr Name vermuten ließe: Im wesentlichen bringt man dabei ein Alkin, das einen beliebigen Rest tragen kann, mit einem Azid (ebenfalls mit beliebigem Rest) in Gegenwart des Katalysators Cu(I) zur Reaktion, wartet bis es „Click“ macht und heraus kommt ein Triazolring mit den zwei Resten als Anhängsel. Für das Nukleinsäure-Labeling via Click-Chemie muss man also lediglich Alkin-modifizierte Oligos mit einem fluoreszenzmarkierten Azid reagieren lassen und erhält nahezu quantitativ fluoreszenzmarkierte Oligos, die man ohne aufwändige Reinigung weiter verwenden kann.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2010, Stand: Oktober 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 15.12.2010


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