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Verklemmte Proteinhäcksler
Produktübersicht: Protease-Inhibitoren

Ungefähr zwei Prozent der Gene eines Organismus, egal ob Mikrobe oder Mensch, codieren für Proteasen beziehungsweise Peptidasen. Viel zu tun also für die Hersteller von Protease-Inhibitoren.

Allein in menschlichen Zellen sollen laut Experten mehr als 500 Proteasen an Proteinen und Peptiden herumschnippeln; etwa 400 davon haben Forscher inzwischen aufgespürt und in Proteindatenbanken archiviert. Proteasen stutzen frisch synthetisierte Proteine zurecht, aktivieren sie mit einem exakt gesetzten Schnitt oder bauen Proteine wieder ab, wenn diese ihren Zweck erfüllt haben. Bei nahezu allen physiologischen Prozessen in einer Zelle sind Proteasen maßgeblich beteiligt und viele Krankheiten und Infektionen, vom Bluthochdruck bis zur HIV-Infektion, sind auf Mutationen oder Fehlregulationen von Proteasen zurückzuführen oder werden von ihnen gesteuert. Im aktiven Zentrum von Proteasen sind in der Regel Serin-, Cystein- oder Aspartat-Reste sowie Metallkomplexe für die Hydrolyse der Peptidbindung verantwortlich. Enzymatiker teilen Proteasen deshalb in die vier Hauptklassen Serin-, Cystein-, Aspartyl- und Metalloproteasen ein.


Verhasste Proteasen

Für viele Biowissenschaftler sind Proteasen äußerst interessante Forschungsobjekt. Es gibt aber auch Life Science Forscher die gar nicht gut auf Proteasen zu sprechen sind. Hierzu gehörten schon immer die Proteinbiochemiker, heute sind es meist die Proteomiker. In Proteinlaboren kann man des öfteren das Wutgeheul frustrierter Doktoranden hören, wenn Proteasen wieder einmal gewütet haben und von den mühsam isolierten Proteinen nur noch Bruchstücke übrig sind.

Um dies zu verhindern, versetzen Proteinanalytiker ihre Zellaufschlüsse routinemäßig mit Protease-Inhibitoren. Früher war das in allen Labor-Kühlschränken omnipräsente Phenylmethylsulfonylfluorid, kurz PMSF, das gängigste Allheilmittel gegen Proteasen, heute ist die Auswahl an Protease-Inhibitoren erheblich größer. Wenn man die ellenlange Liste in der aktuellen Produktübersichts-Tabelle durchgeht, hat man den Eindruck, dass inzwischen gegen jede einzelne Protease ein spezielles Kraut beziehungsweise ein Inhibitor gewachsen ist. Wer will, kann sich bei vorgefertigten Mixturen bedienen, Freunde von Eigenkreationen können aber auch individuelle Inhibitor-Cocktails zusammenstellen, die genau auf das zu erwartende Protease-Spektrum abgestimmt sind.

Obwohl es Hunderte natürlich vorkommender oder synthetisch hergestellter Protease-Inhibitoren gibt, sind die Hemmmechanismen immer wieder gleich. Entweder heften sich die Protease-Inhibitoren irreversibel an das katalytische Zentrum der Proteasen und blockieren es bis ans Ende ihrer Tage. Oder sie konkurrieren als kompetitive Inhibitoren mit dem Substrat beziehungsweise ahmen als Transition-State-Inhibitoren Zwischenstufen der Hydrolysereaktion nach. In einer vierten Variante begehen sie schließlich Selbstmord, indem sie als Suizid-Inhibitoren einen Komplex mit der Protease eingehen, der die Tertiärstruktur der Protease deformiert und sie dadurch inaktiviert.

Aber ganz egal welchen Inhibitor-Cocktail der Proteinanalytiker oder Proteomiker verwendet, er sollte sich nie zu sicher sein, dass er tatsächlich alle Proteasen ausschaltet. Zu diesem Schluss kommt auch ein brandneues Paper des Kanadiers Francis Beaudry von der Universität Montreal (Francis Beaudry, Anal. Biochem., 2010, im Druck). Beaudrys Steckenpferd ist die Regulation von Neuropeptiden und deren Vorläuferproteinen in Nervenzellen. Dazu muss er unter anderem Homogenate aus Rattenrückenmark herstellen und die darin enthaltenen Neuropeptide im Massenspektrometer analysieren.

Beaudry fragte sich, ob es nützt, wenn er seinen Peptidextrakten einen Inhibitor-Cocktail zusetzt, und führte ein einfaches Experiment durch. Er homogensierte das Rückenmark einmal in PBS, einmal in PBS mit Inhibitor-Cocktail und einmal in Trifluoressigsäure (TFA). Die Ansätze inkubierte Beaudry bei 25 °C und entnahm zu verschiedenen Zeiten Aliquots, die er im Massenspektrometer analysierte. Dabei richtete er sein Augenmerk auf drei prominente Neuropeptide des Rückenmarks: Substanz P, CGRP und Dynorphin A.


Ernüchterndes Ergebnis

In den PBS-Homogenaten ohne Zusatz stieg die Konzentration von Substanz P und Dynorphin A schon nach wenigen Minuten an, während die Konzentration von CGRP sank. Die Erklärung hierfür ist naheliegend: Die Vorläuferproteine von Substanz P und Dynorphin A, Protachykinin und Prodynorphin, wurden von Proteasen zu Substanz P und Dynorphin A hydrolysiert und gleichzeitig zerschredderten Proteasen CGRP. Wie aber sah es in den Ansätzen mit zugesetztem Inhibitor-Cocktail aus? Nahezu identisch, auch hier erhöhte sich die Konzentration von Substanz P und Dynorphin A nach wenigen Minuten und die von CGRP ging in den Keller.

Stabil waren dagegen die Neuropeptide in der TFA-Lösung, offensichtlich blockierte der niedrige pH-Wert die Aktivität der meisten Proteasen. Leider stört TFA bei vielen nachfolgenden Prozessen der Proteomik oder Peptidomik und ist deshalb nur bedingt als Alternative zu gebrauchen. Proteinanalytiker und Proteomiker werden also auch weiterhin Protease-Inhibitoren in ihre Proteinextrakte kippen müssen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 10/2010, Stand: September 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 20.10.2010


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