a_lj_p_4_5

Trennungsspezialisten
Produktübersicht: Chromatographie-Systeme

Trennungsspezialisten

Chromatographie-Systeme, allen voran HPLC-Instrumente, gehören schon lange zum Standardinventar vieler biochemischer oder proteinanalytischer Labors. Die technische Entwicklung hält aber auch hier nicht inne.

Wenn Biowissenschaftler von Flüssigchromatographie oder Säulenchromatographie reden, meinen sie meist eine der vielen Varianten der Hochdruckflüssigchromatographie, kurz HPLC. So ausgefeilt moderne HPLC-Systeme und Geräte mittlerweile sein mögen, an dem zugrundeliegenden Trennprinzip hat sich seit den Tagen des Chromatographie-Erfinders Michael Semjonowitsch Tsweet nichts geändert, der schon 1903 Pflanzenfarbstoffe in Chromatographiesäulen trennte.

Bei der klassischen Säulenchromatographie lädt man Substanzen oder Proteine, die in einem entsprechenden Laufmittel gelöst sind das als mobile Phase agiert, auf eine mit Kieselgel, Dextran oder einer anderen stationären Phase gefüllte Chromatographiesäule. Auf ihrem Weg durch das Labyrinth des Säulenmaterials wechselwirken die Verbindungen über physikalische oder chemische Kräfte mit den Molekülen an der Oberfläche des Packungsmaterials. Weil jede Substanz des aufgetragenen Gemischs unterschiedlich stark mit der stationären Phase interagiert, trennen sie sich auf dem langen Weg durch die Säule und kommen fein säuberlich auseinander dividiert am Säulenausgang an. Dort werden die Substanzen von einer Detektionseinheit registriert und als Signalspitze (Peak) in einem Chromatogramm aufgezeichnet.

Zu Tsweets Zeiten und bis weit in die siebziger Jahre des vergangen Jahrhunderts hinein war es üblich, die teils armdicken und ellenlangen gläsernen Chromatographiesäulen noch selbst mit modifiziertem Kieselgel zu befüllen. Nach dem Start der Chromatographie hieß es dann meist stundenlang warten und Auffanggläschen wechseln bis die gewünschte Substanz, angetrieben allein durch die Schwerkraft, endlich aus dem Auslaufhahn tropfte.

Findige Apparatebauer kamen schließlich auf die Idee, der mobilen Phase mit kleinen Kolbenpumpen auf die Sprünge zu helfen. Mittlerweile haben sie die Hochdruckflüssigchromatographie so weit perfektioniert, dass selbst die wildesten Substanz- oder Proteingemische fein säuberlich getrennt nach wenigen Minuten aus den filigranen HPLC-Säulchen austreten.

Da Glas den in den Säulen auftretenden hohen Rückdrücken von mehreren hundert bis teilweise über tausend Bar, nicht standhalten würde, baut man in der Regel Chromatographiesäulen aus druckstabilem Edelstahl in die HPLC-Geräte ein. Entscheidend für Trennleistung und Effizienz der Säule sind aber nach wie vor das Material, die Struktur und die Partikelgröße der Säulenpackung. Schaut man sich die Tagungsprogramme einschlägiger Chromatographie-Kongresse an, scheint insbesondere die Korngröße des Säulenmaterials ein derzeit heißdiskutiertes Thema unter HPLC-Experten zu sein. Der vorherrschende Trend ist eindeutig: Die Partikeldurchmesser werden immer kleiner.


Sinkende Korngrößen

Bis vor wenigen Jahren galten Korngrößen von drei bis fünf Mikrometern als optimal, um eine HPLC mit den üblichen fünf Millimeter Säulen (Innendurchmesser) und dem gängigen HPLC-Druck von 400 Bar durchzuführen. Inzwischen sind sie unter zwei Mikrometer gesunken. Je kleiner die Kügelchen des Packungsmaterials, desto schneller und gleichmäßiger marschieren die Probenmoleküle durch die Säulenmatrix. Dass hieraus kürzere Laufzeiten, eine höhere Trenneffizienz und schärfere Peaks, sprich besser getrennte Substanzen resultieren, wissen HPLC-Spezialisten aus theoretischen Überlegungen schon seit den Anfangszeiten der HPLC. Die technische Umsetzung gelang ihnen aber erst in den letzten Jahren.


Hoher Gegendruck

Das Hauptproblem kleiner Packungskügelchen ist der damit einhergehende hohe Säulendruck, der bei so genannten sub-Zweimikrometer-Partikeln (sub-2 µm) schnell auf mehrere 1000 Bar ansteigen kann. Einige Hersteller konstruierten deshalb ultra-High Pressure Chromatographie-, kurz uHPLC-Geräte, die auch bei extrem hohen Drücken arbeiten. Andere begrenzen den Rückdruck auf unter 1000 Bar, indem sie die Säulentemperatur erhöhen und so die Viskosität des Laufmittels verringern.

Nicht jedes Labor hat jedoch das nötige Kleingeld, um sich ein teures uHPLC-Instrument anzuschaffen und manchen fällt es schlicht schwer, sich von erprobten HPLC-Geräten und -Protokollen zu verabschieden.

Wer dennoch die Effektivität und Selektivität von HPLC-Läufen bei Standarddrücken erhöhen will, kann dies mit Säulen versuchen, in denen zweischichtig aufgebaute Partikel stecken. Diese­ bestehen aus einem undurchlässigen harten Kern und einer nur einen halben Mikrometer dicken porösen Hülle. Letztere sorgt dafür, dass sich die diffusionsbedingten Umwege der Probenmoleküle innerhalb der Kügelchen auf ein Minimum beschränken. Trotz des „großen“ Partikel-Durchmessers von etwa drei Mikrometern erzielen diese Säulen, so die Hersteller, auch bei den üblichen HPLC-Drücken von etwa 400 Bar, ähnliche Trennleistungen wie uHPLC-Geräte mit sub-2 µm-Partikel-Säulen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 02/2010, Stand: Februar 2010, alle Angaben ohne Gewähr)


Hier erhalten Sie diese Produktübersicht als Acrobat Datei (.pdf):

A4 Format zum Ausdrucken




Letzte Änderungen: 26.04.2010


Impressum | Datenschutz | Haftungsausschluß

© 1996-2016 LJ-Verlag GmbH & Co. KG, Freiburg, f+r internet agentur, Freiburg,
sowie - wenn nicht anders gekennzeichnet - bei den jeweiligen Autoren und Fotografen.