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Kits zum Rückwärts-Kopieren
Produktübersicht: RT-PCR

Ob konventionelle Endpunkt-oder Echtzeit-RT-PCR, für den ersten Schritt braucht man immer einen Reverse-Transkriptase-Kit.

Eigentlich müssten Molekularbiologen in einer stillen Ecke ihres Labors einen Andachtschrein einrichten und jeden Tag ein Dankgebet an den Entdecker der Reversen Transkriptase, David Baltimore, und den Erfinder der PCR, Karry Mullis, sprechen. Ohne Reverse Transkriptase und PCR sowie der Kombination aus beiden, der RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PCR), wären die heutigen Molekularbiologen arme Tröpfe, die vermutlich nicht wüssten, was sie in ihren Laboren anfangen sollen. Die meisten Biologen wären aufgeschmissen, wenn sie Genexpressions­analysen mit althergebrachten Northern Blots durchführen müssten, statt mit der Real-Time-RT-PCR, und auch bei der Herstellung von cDNA-Bibliotheken, der Detektion von Viren und anderen Pathogenen oder der Expressionsanalyse von micro-RNAs kämen sie ohne RT-PCR arg ins Schwimmen.


Ein oder zwei Schritte

Je nach zugrunde liegendem Enzymsystem lassen sich RT-PCR Kits in drei Kategorien einteilen: Zwei-Gefäß (Tubes)/Zwei Enzym-Systeme, Ein-Tube/Zwei-Enzym-Systeme und Ein-Tube/Ein-Enzym-Systeme. Bei Ersteren führt man die RT-PCR Reaktion in zwei Schritten in separaten Reaktionsgefäßen durch. Zunächst schreibt die Reverse Transkriptase die RNA in cDNA um, die optimale Arbeitstemperatur liegt je nach Herkunft des Enzyms zwischen 37° C und 50° C. Anschließend öffnet man das Eppendorf-Tube, entnimmt ein Aliquot und pipettiert dieses in ein zweites Gefäß, in dem eine thermostabile Polymerase darauf wartet, die synthetisierte cDNA bei 72° C zu vervielfältigen. Zwei-Tube/Zwei-Enzym-Systeme haben den Vorteil, dass sich beide Teilschritte unabhängig voneinander optimieren lassen und man im RT-Schritt zwischen sequenzspezifischen und zufälligen Primern wählen kann. Mit letzteren lässt sich die komplette RNA in cDNA umschreiben und dann als Matrize für die anschließende PCR mit unterschiedlichen Primern einsetzen. Das Ganze hat jedoch einen Haken. Weil man den Deckel des Reaktionsgefäßes nach dem RT-Schritt öffnen muss, um Reaktionsansatz samt cDNA heraus zu pipettieren, erhöht sich auch das Kontaminationsrisiko.

Da Molekularbiologen Verunreinigungen in PCR-Ansätzen fürchten wie der Teufel das Weihwasser, verwenden sie häufig Ein-Tube/Zwei-Enzym- oder Ein-Tube/Ein-Enzym-Systeme.

Ein-Tube/Zwei-Enzym-Kits enthalten üblicherweise einen Puffer, in dem sich sowohl Reverse Transkriptase als auch DNA-Polymerase wohl fühlen. Nach der cDNA Synthese entledigt man sich der Reversen Transkriptase indem man sie einige Minuten 95° C aussetzt. Noch eleganter sind Ein-Tube/Ein-Enzym-Systeme, bei denen das aus dem Bakterium Thermus thermophilus stammende Multitalent tTh-Polymerase das Umschreiben der RNA in cDNA und die PCR übernimmt. tTh-Polymerase arbeitet in Gegenwart von Mangan-Ionen und Temperaturen unter 65° C als Reverse Transkriptase und verwandelt sich über 65° C und in Anwesenheit von Magnesium-Ionen in eine DNA-Polymerase. Mittlerweile muss man die Reaktion auch nicht mehr wie früher unterbrechen und die Mn2+-Ionen mit einem Komplexbildner herausfischen, um die tTh umzupolen. Dank optimierten Puffern und Mn2+-Konzentrationen sowie Hot-Start-Antibodies, die die Polymerase-Aktivität punktgenau bei der gewünschten Temperatur freigeben, reicht es aus die Temperatur von etwa 60° C auf 72° C zu erhöhen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 7/2009, Stand: Juni 2009, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 13.06.2009


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