• 
• Aktuelle Ausgabe
• Methoden
• Labortricks
• Rankings
• Produktübersicht
• Buchbesprechungen
• Wissen pur
• Schöne Biologie
• Ansichten eines Profs
• Alle Editorials
• Archiv
• 
  
• Vorträge
• Kongresse
• Schulungen
• Jobs
• Bio-Links
• Bio-Landkarte
• 
  
• Die Lab-Files
• Laborkatastrophen
• Forscher Ernst
• 
  
• Redaktion
• LJ Mediadaten/Preise
• F+R Internet Agentur
• Impressum

Immer-schneller-immer-mehr
Produktübersicht: Hochdurchsatzscreening

Die schnellsten Roboter helfen wenig, wenn der Screening-Assay nichts taugt und den Wirkstoff-Forscher mit falschpositiven Treffern narrt.

Herzstück des Wirkstoff-Screenings sind nicht wild mit ihren Armen fuchtelnde Roboter, sondern zellbasierte- oder bio-chemische Hochdurchsatz-Assays (HTS-Assays). Aber nur wenn der Assay passt, kann man zuverlässig zwischen Wirkstoff-Nieten und erfolgversprechenden Wirkstoff-Kandidaten unterscheiden.

So funktionieren Zellassays, die für den "Handbetrieb" konzipiert wurden, nicht automatisch auch im Hochdurchsatz. Da Screening-Roboter bei Raumtemperatur arbeiten und Kühlschritte während des Screenings zusätzlichen Aufwand verursachen, müssen HTS-taugliche Assay-Reagenzien bei Zimmertemperatur stabil sein. Zusätzlich sollten sie ein Signal liefern, das sich auch über einen längeren Zeitraum messen lässt. Die gängigen manuellen Assays, etwa Zellzyklus-Assays, Zyto-toxizitäts-Assays, Kinase- und G-Protein-gekoppelte Rezeptor-Assays (GPCR) oder Apoptose-Assays einfach nur auf Hochdurchsatz zu trimmen und zu skalieren, ist daher in vielen Fällen nicht besonders clever.

Ohne Fluoreszenz sowie Chemi- und Biolumineszenz wären die heutigen HTS-Assays nicht denkbar. Praktisch alle basieren auf Reaktionen, die fluoreszierendes oder lumineszierendes Licht aussenden. Dieses dient den Mikrotiterplatten-Lesegeräten in den Screening-Automaten als einfach auszuwertendes Signal.

Sehr beliebt bei den Herstellern zellbasierter HTS-Assays sind Biolumineszenz-Reaktionen, die sie zum Beispiel für die Detektion in GPCR-Assays einsetzen. Dazu positionieren die Assay-Entwickler ein cAMP-response Element (CRE) vor einem Luziferase-Reportergen. Erhöht sich die Aktivität des GPC-Rezeptors, steigt auch die Konzentration von cAMP, das seinerseits die Proteinkinase A auf Trab bringt. Diese phosphoryliert ein CRE-bindendes Protein, das sich daraufhin verstärkt an das CRE-Element klammert und so die Trans-kription des Luziferase-Gens antreibt. Der Wirkstoffscreener muss in diesem Fall also nur den Anstieg der Lumineszenz in den Näpfchen der Mikrotiterplatten verfolgen, um zu sehen, ob der GPC-Rezeptor aktiv ist.

Die Luziferase-katalysierte Reaktion von Luziferin und ATP zur Zwischenstufe Luziferyl-AMP bietet sich auch an, um die Zytotoxizität von Substanz-Bibliotheken auf Zellen zu messen. Auch hier ist das Messprinzip einfach. Die intrazelluläre ATP-Konzentration sinkt unmittelbar nach dem Ableben einer Zelle. Im gleichen Maße verringert sich auch die Reaktion von Luziferin und ATP. Der Wirkstoff-Screener muss somit nur beobachten, in welchen Zellen das Biolumineszenz-Licht ausgeht.


Hochdurchsatz für alle

In den Roboterstraßen der Pharmafirmen sind Wirkstoffscreenings mit HTS-Assays seit Jahren Routine. Inzwischen sind sie aber auch in der akademischen Forschung auf dem Vormarsch. Immer mehr akademische Servicezentren und zentrale Forschungseinrichtungen bieten Hochdurchsatzscreenings als Serviceleistung an. Während kleinere Einheiten meist nur für institutseigene Forscher offen sind, führen größere, wie die Screening-Unit am Leibnitz-Institut für Molekulare Pharmakologie in Berlin, auch für auswärtige Forscher oder Biotechfirmen Wirkstoffscreenings durch oder ent-wickeln maßgeschneiderte HTS-Assays.

Die Berliner sind Teil der "ChemBioNet"-Plattform, in der sich etliche Hochdurchsatzspezialisten aus der Chemischen Biologie zusammengefunden haben. Zu diesen zählt auch Roland Frank vom Helmholtz Zentrum für Infektionszentrum in Braunschweig. Ein Projekt seiner Gruppe "Chemische Biologie", das diese zusammen mit Nisar Malek von der Medizinischen Hochschule Hannover und Markus Kalesse von der Leibnitz-Universität Hannover bearbeitet, zeigt exemplarisch, dass Hochdurchsatz-Screenings und -Assays auch in der akademischen Grundlagenforschung Sinn machen.

Franks Mannschaft entwickelte einen zellbasierten Assay, mit dem sie in verschiedenen Stoffsammlungen nach Substanzen suchten, die den Abbau des Cyclin-Kinase-Hemmers p27 verhindern. Niedere p27-Konzentrationen beschleunigen die Zellproliferation und können so zur Tumorentstehung beitragen. Substanzen, die den Abbau von p27 bremsen sind deshalb interessante Anti-Tumor-Wirkstoffkandidaten.

Für den Assay exprimierten Franks Mitarbeiter ein p27-GFP Fusions-Protein in HeLa-Zellen und screenten diese gegen verschiedene Substanzbibliotheken. Die p27-Konzentration in den Zellen bestimmten sie anhand der GFP-Fluoreszenz mit einem Platten-Lesegerät. Franks Leute landeten mit ihrem Screening-Verfahren tatsächlich einen Volltreffer. Ihnen ging dabei das Myxobakterium-Peptid Agyrin A ins Netz, das offensichtlich den Abbau von p27 durch das Proteasom blockiert und derzeit als heißer Wirkstoffkandidat gehandelt wird.


Assays von der Stange

Wer in seinem Labor ähnliche Hochdurchsatz-Screenings durchführen will, kann dazu vorgefertigte HTS-Assays verwenden oder diese selbst entwickeln. Wer letzteres vorhat, sollte sich das Assay-Guidance-Manual der Hochdurchsatz-Spezialisten des NIH Chemical Genome Centers (www.ncgc.nih.gov/guidance/index.html) zu Gemüte führen. Wer sich die Mühe sparen will, kann sich auf den nächsten Seiten einen passenden HTS-Assay aussuchen.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2008, Stand: Oktober 2008, alle Angaben ohne Gewähr)


Hier erhalten Sie diese Produktübersicht als Acrobat Datei (.pdf):

A4 Format zum Ausdrucken




Letzte Änderungen: 29.12.2008