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Hab ich dich!
Produktübersicht: Protease-Assays

Krokodil
Wie Krokodile sind auch Proteasen nicht besonders wählerisch, wenn sie sich ein Proteinfetzen schnappen können.

Es gibt wohl kaum einen Signal- oder Stoffwechselweg, in dem nicht auch eine Protease ihre Enzym-Finger mit im Spiel hat. Kein Wunder also, das der Bedarf an Protease-Assays groß ist.

Protease-Experten schätzen, dass etwa zwei Prozent aller proteinkodierenden Gene Proteasen respektive Peptidasen kodieren. Das ist eine ganze Menge. So sind allein beim Menschen mehr als 500 verschiedene Proteasen permanent damit beschäftigt Proteine zurechtzustutzen oder sie komplett zu zerlegen. Für Hersteller von Protease-Assays ist diese große Zahl an Proteasen eine gemähte Wiese und so wundert es nicht, das sie sich darauf nach Herzenslust austoben. Dies um so mehr, da sich von den 500 Proteasen des Menschen auch noch mehr als 60 im Fadenkreuz von Wirkstoffentwicklern befinden.

Die Käufer von Protease-Assays lassen sich im Grunde in zwei große Gruppen einteilen: In Protease-Liebhaber und in Protease-Hasser. Zur ersteren zählen Forscher, die mit Protease-Assays die Funktion ihrer Lieblingsprotease zum Beispiel bei Apoptose, HIV-Virus-Infektion oder Tumorentwicklung untersuchen. Hier ist die Freude meist groß, wenn man mit dem neuen Kit die langgesuchte Protease nachweisen kann. Zu den Protease-Hassern zählen die Proteinreiniger, die heilfroh sind, wenn sie von Proteasen verschont bleiben, die das frischgereinigte Protein zerschreddern, bevor es im Gefrierschrank in Sicherheit ist.


Alle auf einen Streich

Im Gegensatz zu den Protein-Putzern, die in der Regel unspezifische Protease-Assays bevorzugen, mit denen sie ein ganzes Protease-Potpourri aufspüren können, favorisieren Protease-Liebhaber meist spezifische Assays. Mit diesen lassen sich zum Beispiel gezielt einzelne Caspasen der Apoptose-Kaskade oder virale Proteasen wie die HIV-1 Protease detektieren.

Da Proteasen ziemlich schlichte Enzyme sind, die nichts anderes können als Peptidbindungen hydrolytisch spalten, nutzt man für spezifische Assays eine ihrer weiteren Eigenschaften aus: Proteasen spalten Peptidbindungen nicht an beliebigen Stellen, sondern nur an ausgesuchten Positionen. So schneiden zum Beispiel Endopeptidasen nur im "Inneren" von Proteinen, Omega-Peptidasen im Inneren, aber in der Nähe der Protein-Enden (Termini), und Exopeptidasen nur von den Enden her. Noch ausgefallenere Wirkort-Vorlieben pflegen Aminopeptidasen, Di- und Tripeptidylpeptidasen, Carboxypeptidasen, Peptidyl-dipeptasen und Dipeptidasen. Hinzu kommt, dass viele Proteasen ihre Substrate nur an ausgewählten Erkennungs-Sequenzen mit einer ganz bestimmten Abfolge der Aminosäurereste hydrolysieren.


Peptide als Köder

Für die Entwickler und Hersteller von spezifischen Protease-Assays ist die Wirk-ort-Spezifität der Proteasen ein Geschenk des Himmels. Statt diesen ein komplettes Protein in den Rachen zu schmeisen, auf das sich viele unterschiedliche Proteasen stürzen, verwenden die Assay-Hersteller nur kurze, spezifische Peptide als Substrate, nach denen im Idealfall nur eine einzige Protease schnappt.

Peptide mit der passenden Aminosäuresequenz reichen jedoch noch nicht aus, um die proteolytische Attacke der anvisierten Protease auch tatsächlich "sehen" beziehungsweise messen zu können. Dazu verknüpfen die Assay-Produzenten die Peptide meist mit Farbstoffmolekülen, die nach der Hydrolyse durch die Protease ein Farbsignal aussenden. Immer mehr Hersteller setzen dabei Farbstoffe ein, deren Fluoreszenz sich durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) "abwürgen" (quenchen) lässt. Das Prinzip der FRET-Protease Assays ist so einfach wie genial. An das als Protease-Substrat dienende Peptid werden zwei benachbarte Fluoreszenzfarbstoffe in einem Abstand von etwa zwei bis acht Nanometern angehängt. Einer der beiden agiert als FRET-Donor, der andere als FRET-Akzeptor. Nur wenn Akzeptor und Donor so eng aufeinander sitzen, und gleichzeitig das Absorptionspektrum des Ersteren mit dem Emissionsspektrum des Letzteren überlappt, funktioniert der FRET-Energietransfer. Bei diesem überträgt der Donor einen Großteil seiner Energie strahlungslos über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf den Akzeptor, wodurch die Fluoreszenz des Donorfarbstoffes fast vollständig unterdrückt (gequenched) wird.

Dann kommt die Protease ins Spiel. Sie schneidet das Peptid an der jeweiligen Erkennungssequenz, die zwischen Donor und Akzeptor liegt, und trennt die beiden voneinander. Der FRET-Energietransfer stoppt dadurch und der Donor kann wieder mit voller Kraft fluoreszieren. Letztendlich muss man bei den FRET-Protease Assays also nur die Zunahme der Fluoreszenzintensität mit einem Fluoreszenz-Spektrometer messen.

Neben FRET-Assays sind noch viele weitere kolorimetrische, fluorimetrische oder auf Bioluminzenz basierende Protease-Assays auf dem Markt. Auf den nächsten Seiten können sie einen aussuchen, der perfekt zu Ihrer Lieblings-Protease passt.


(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 10/2008, Stand: September 2008, alle Angaben ohne Gewähr)


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Letzte Änderungen: 17.10.2008


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