Ein magnetisches Induktionsfeld erhitzt die PCR-Ansätze in John Corbetts neuem Karussell-Cycler. Foto: Winfried Köppelle
Noch dominieren Silberblöcke sowie Heißluftkarussells das Innenleben von qPCR Thermocyclern. In immer mehr Modellen finden sich jedoch alternative Heizkonzepte.
Die technischen Anforderungen an einen Real-Time-PCR oder kurz qPCR-Thermocyler sind im Grunde sehr einfach und klar umrissen: Eine Heizquelle muss zwei bis drei Dutzend Temperaturzyklen durchlaufen und die PCR-Ansätze hierbei in definierten Zeitintervallen zunächst auf 90 bis 98 °C erhitzen, anschließend auf 50 bis 65 °C abkühlen und zum Abschluss wieder auf 70 bis 80 °C erwärmen. Gleichzeitig muss ein optisches System die entstehenden, fluoreszierenden DNA-Amplikons erfassen und anhand der Stärke des Fluoreszenzsignals ihre Menge bestimmen.
Das Gerät sollte zudem nicht zu viel Strom verbrauchen, problemlos auf der Bench Platz finden – oder für mobile Einsätze am besten in die Kitteltasche passen –, das Budget einer durchschnittlichen Arbeitsgruppe nicht über Gebühr belasten, einfach zu bedienen sein und, last but not least, nicht gerade potthässlich daherkommen.
Interessant ist, welche unterschiedlichen Lösungsansätze den Entwicklungsingenieuren, insbesondere bei der Ausführung der Heizquelle von qPCR-Thermocyclern, hierzu einfielen. Die klassische, immer noch am weitesten verbreitete Variante sind massive Heizblöcke aus Aluminum oder Silber, die mit thermoelektrischen Peltier-Elementen erhitzt und gekühlt werden. Die maximalen Heizraten durchschnittlicher Blockcycler bewegen sich meist zwischen zwei und fünf Grad Celsius pro Sekunde, die entsprechenden Kühlraten sind in der Regel etwas langsamer. Schnellere Heizraten bis zu 12 °C pro Sekunde und Kühlraten von 8 °C/s erreichen nur hochpreisige Geräte mit goldbeschichteten Silberblöcken. Das größte physikalische Problem von Blockcyclern ist aber auch bei diesen High-End-Instrumenten nicht vollständig vom Tisch: Die Temperatur ist nicht exakt gleichmäßig über den Heizblock verteilt. Selbst bei den besten Blockcyclern liegt die Temperatur- oder Blockuniformität bei etwa ± 0,2 °C. Kleine Unregelmäßigkeiten innerhalb des Silberblocks verhindern bei Blockcyclern eine homogenere Temperaturverteilung.
Axel Scherers Gruppe am California Institute of Technology kam deshalb vor etwa zehn Jahren auf die Idee, den Silberblock auszuhöhlen und mit einer wärmeleitenden Metalllegierung zu füllen. Spezielle Agitatoren pumpen die mit Peltier-Elementen temperierte Legierung durch den Hohlraum des Heizblocks. Mit diesem Trick erreicht Scherers Hohlblockcycler eine Blockuniformität von unter einem Zehntel Grad Celsius. Der Hohlblockcycler wurde bis 2013 zunächst vom NGS-Giganten Illumina weiterentwickelt. Nach Illuminas Ausstieg aus dem Thermocycler-Geschäft ist er inzwischen bei dem englischen Laborausrüster Bibby Scientific gelandet.
Spitzenreiter in Sachen Temperaturuniformität sind aber nach wie vor luftbeheizte Karussellcycler. Bereits 1997 stellte das kleine US-Unternehmen Idaho Technologies den Light Cycler vor, bei dem sich die Reaktionsgefäße auf einem Karussell im Kreis drehen. Einige Jahre später entwickelte der australische Ingenieur John Corbett mit dem Rotor-Gene einen weiteren Karussellcycler. Idaho Technologies vertickte die Idee des Light Cyclers ziemlich schnell an Boehringer Mannheim, das fast zeitgleich von Roche geschluckt wurde. Und auch John Corbett machte mit seiner Erfindung Kasse und verkaufte seine Firma Corbett Life Sciences 2008 mitsamt dem Rotor-Gene an Qiagen.
Nicht geändert hat sich während dieser Firmenrochaden jedoch das genial einfache Funktionsprinzip von Light Cycler und Rotor-Gene. Beim Light Cycler findet die PCR in langen dünnen Glaskapillaren statt, die in einem rotierenden Karussell fixiert sind und in eine zylindrische Heizkammer hineinragen. Ein kleiner Ventilator am Boden der Kammer saugt Luft über eine Heizwendel in den Heizraum und bläst sie über seitlich angebrachte Öffnungen wieder aus diesem hinaus. Während der Heizzyklen fließt Strom durch die Wendel und erhitzt sie. In den Abkühlphasen bleibt die Heizwendel dagegen aus, statt dessen läuft der Ventiltor schneller und saugt mehr kühle Luft in die Kammer. Den Antrieb des Karussells übernimmt ein Schrittmotor, der die Kapillaren während der Fluoreszenzmessungen exakt in der optischen Achse des Anregungslichts positioniert.
Ganz ähnlich funktioniert auch der Rotor-Gene. Statt Glaskapillaren verwendet man bei diesem jedoch PCR-Tubes, die in einem Zentrifugenrotor stecken, der durchlöchert ist wie ein Schweizer-Käse, um einen optimalen Luftaustausch zu erzielen. Angetrieben von einem Ventilator strömt Luft über Heizelemente in den Rotorraum, für die Kühlung sorgt ein zweites Gebläse, das Umgebungsluft durch den Rotor pustet.
Im Gegensatz zum Light Cycler dreht sich der Rotor jedoch nicht in winzigen Einzelschritten sondern kontinuierlich. Die Drehfrequenz ist mit der optischen Einheit des Geräts synchronisiert, wodurch sichergestellt ist, dass die Enden der Reaktionsgefäße jeweils im 150-Millisekundentakt das Anregungslicht einer LED-Lampe passieren.
Da die heiße Luft die Reaktionsgefäße sowohl beim Light Cycler als auch beim Rotor-Gene sehr gleichmäßig umströmt, sind die Temperaturabweichungen zwischen den Gefäßen verschwindend gering und liegen beim Rotor Gene unter 0,02 °C. Begünstigt durch die geringe Wärmekapazität von Luft, haben Karussellcycler auch bei den Heizraten die Nase vorn. So erreicht zum Beispiel der Light Cycler 2.0 Heizraten von bis zu 20 °C pro Sekunde.
In den letzten Jahren tauchten zunehmend Geräte mit alternativen Heizkonzepten auf. Zu diesen zählt zum Beispiel der 2006 von Cepheid eingeführte Smart Cycler, der mit bis zu 96 sogenannten i-core-Modulen bestückt ist, die an Druckpatronen für Tintenstrahl-Drucker erinnern. Jedes i-core-Modul besteht aus einem wärmeleitenden Keramikplättchen, einem winzigen Ventilator sowie zwei integrierten optischen Systemen.
Die PCR findet in speziellen, Pfeilspitzen-ähnlichen Reaktionsgefäßen statt, die in schmale Schlitze in den Keramikplättchen eingeschoben werden. Winzige Heizwiderstände auf der Oberfläche der Plättchen heizen diese auf, sobald ein Strom durch sie hindurchfließt, die Kühlung erfolgt durch den Luftstrom des Mini-Ventilators. Da jedes i-core-Modul autark arbeitet, sind theoretisch bis zu 96 verschiedene qPCR-Protokolle möglich.
Auch der von der englischen Firma BJS Biotechnologies 2013 auf den Markt gebrachte Xxpres Cycler nutzt die Wärmeentwicklung elektrischer Widerstände für die Heizung der PCR-Ansätze. Die Stelle des Heizblocks nimmt hier ein mit 24, 56 oder 96 Reaktionsvertiefungen versehenes Metallplättchen ein, das sich aufheizt, sobald es von einem Niedervoltstrom durchflossen wird. Wie beim Smart Cycler reduziert der Luftstrom eines kleinen Ventilators die Temperatur der PCR-Ansätze während der jeweiligen Abkühlphasen. Dank einer flotten Heizrate von bis zu 10 °C/s sind mit dem britischen Thermocycler 40 qPCR-Zylen in weniger als zehn Minuten möglich.
Äußerst einfallsreich ist das Heizkonzept des Magnetic Induction Cyclers (MIC), den das Vater-Sohn-Duo John Corbett Senior und John Corbett Junior auf der diesjährigen Biotechnica in Hannover vorstellte. Offensichtlich wollte sich John Corbett Senior nicht auf den 70 Millonen Dollar ausruhen, die ihm der Verkauf seiner Firma an Qiagen einbrachte. Und trotz seines fortgeschritten Alters scheint sein Erfindergeist noch hellwach zu sein. Beim Kochen von Kaffeewasser auf einem Induktionsherd, so erzählte Corbett Senior auf der Biotechnica einem Kamerateam, kam er auf die Idee, einen qPCR-Thermocycler zu konstruieren, der ein magnetisches Induktionsfeld als Heizquelle nutzt.
Ausgangspunkt des magnetischen Induktionscyclers ist ein Karussellcycler mit einem Rotor, in dessen Steckplätzen die Reaktionsgefäße unterbracht sind. Das magnetische Induktionsfeld erzeugt eine Spule, die den Rotor ringförmig umgibt und Radiowellen im Frequenzspektrum von 5 bis 100 kHz erzeugt. Treffen diese auf magnetisch induzierbare Materialien, etwa Eisen, so entstehen in diesen aufgrund von elektromagnetischen Wechselwirkungen sogenannte Eddy-Ströme, die bedingt durch den elektrischen Widerstand des induzierten Materials, Wärme erzeugen. Bei einem Induktionsherd erhitzt sich auf diese Weise die eisenhaltige Bratpfanne, beim Induktionscycler könnte man mit dieser Methode sowohl den Rotor als auch die Reaktionsgefäße separat erhitzen. Hierzu müsste man letztere zum Beispiel mit einem eisenhaltigen Material versehen.
Wie John Corbett Senior dieses nicht unwichtige Detail, das sich unmittelbar auf die Heizraten auswirkt, umgesetzt hat, ist aus den spärlichen Informationen, die derzeit für den Induktions-Cycler erhältlich sind, nicht ersichtlich. Beide Möglichkeiten sind jedoch in der von den beiden Corbetts eingereichten Patenschrift angedeutet. Wie beim Rotor-Gene erfolgt die Kühlung ganz konventionell mit einem Ventilator. Die Heiz- und Kühlraten des würfelförmigen, nur 15 auf 15 Zentimeter großen Induktionscycler sind mit vier beziehungsweise drei Grad Celsius nur besserer Durchschnitt. Dafür glänzt er mit einer sehr guten Temperaturuniformität von 0.05 °C.
Wo Sie den Induktionscycler bereits erstehen können und welche weiteren interessanten qPCR-Thermocycler derzeit von den etablierten Herstellern angeboten werden, erfahren Sie auf den nächsten Seiten.
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 12/2015, Stand: November 2015, alle Angaben ohne Gewähr)
