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mikroRNAs regulieren die Expression tausender Gene und steuern hierdurch zahllose Prozesse in der Zelle. miRNA-Expressionsprofile liefern deshalb wichtige Informationen über das Geschehen in gesunden oder kranken Zellen.
Nachdem die Gruppen der beiden amerikanischen Wurmforscher Victor Ambros und Gary Ruvkun 1993 die erste mikroRNA (miRNA), lin-4, in C. elegans entdeckt hatten, fürchteten sie zunächst auf einen nur in Nematoden existierenden, exotischen Regulationsmechanismus gestoßen zu sein. Tatsächlich mussten sie sieben weitere Jahre warten, bis Ruvkuns Team in Harvard mit let-7 die nächste miRNA ebenfalls in C. elegans aufspürte.
Danach ging es jedoch Schlag auf Schlag. Schnell stellte sich heraus, dass let-7, das in Nematoden die Larvenentwicklung steuert, auch in vielen anderen Organismen konserviert ist, etwa in Fliegen und in Homo sapiens. Die Jagd auf weitere miRNAs war damit eröffnet. Inzwischen zählt die 2002 eingerichtete miRNA-Datenbank miRBASE 28.645 Einträge – allein 1881 davon stammen von humanen miRNA-Sequenzen.
Zusätzlich angefacht wurde die Suche durch den Anfang des neuen Milleniums aufkommenden Verdacht, dass miRNAs bei vielen Krankheiten, insbesondere Krebs, eine gewichtige Rolle spielen. Dass sich dieser Verdacht rasch bestätigte, ist nicht weiter verwunderlich: miRNAs kodieren nicht für Proteine, sondern greifen auf post-transkriptionaler Ebene in die Expression vieler Gene ein.
Bei diesem Prozess wird zunächst von der Endonuclease Dicer ein 20 bis 25 Nukleotide langer miRNA-Duplex aus der Vorläufer-miRNA geschnitten. Einer der beiden miRNA-Stränge, der Guide-Strang, wird auf den RNA-induzierten Silencing Complex (RISC) geladen und führt diesen zur komplementären Ziel-mRNA.
Je nach Grad der Übereinstimmung mit der Zielsequenz verdaut der RISC-Komplex die anvisierte mRNA oder verhindert ihre Translation. Da miRNAs – im Gegensatz zu den ebenfalls von DICER und dem RISC-Komplex prozessierten siRNAs – nicht perfekt zur Zielsequenz passen müssen, kann eine einzelne miRNA hunderte verschiedener mRNAs kontrollieren. Experten schätzen, dass miRNAs auf diese Weise gut die Hälfte aller proteinkodierenden Gene in Säugerzellen regulieren.
miRNA-Expressionsprofile und -muster enthalten deshalb eine Fülle biologischer Informationen, die Auskunft über die Entwicklung von Organismen oder fehlgeleitete Prozesse in Krebszellen geben. Kein Wunder, dass das Interesse an ihnen enorm gestiegen ist und viele Forscher versuchen, diesen biologischen Schatz zu heben. Um sich das Leben dabei zu erleichtern, greifen viele zu kommerziellen Systemen oder Plattformen, die die miRNAs zumeist mittels RT-qPCR, miRNA-Microarrays oder miRNA-Sequenzierung (RNA-seq) aus dem riesigen RNA-Pool der Zelle herausfischen (in dem miRNAs nur einen winzigen Bruchteil ausmachen).
Die größte Herausforderung für Plattformen, die auf der RT-qPCR basieren, sind die geringe Länge der miRNAs und ihre teilweise nur graduellen Sequenzunterschiede in einigen miRNA-Familien. Da konventionelle qPCR-Primer an den kaum mehr als zwanzig Nukleotiden langen miRNAs scheitern, mussten sich die qPCR-Entwickler etwas anderes einfallen lassen.
Bei TaqMan-basierten qPCR-Plattformen enthalten die Kits zumeist Haarnadel-Primer (Stem-Loop Primer), die spezifisch an die 3‘-Enden der Ziel-miRNA binden und zunächst eine Haarnadelstruktur an das Ende einführen. Im anschließenden Denaturierungs-Schritt öffnet sich die Haarnadel, woraus ein einsträngiges miRNA-Stem-Loop-Fragment mit mehr als 60 Nukleotiden resultiert (etwa 20 stammen von der miRNA, die restlichen vom Stem-Loop-Primer). An dieses Konstrukt binden im eigentlichen RT-qPCR-Schritt ein miRNA-spezifischer Vorwärts-Primer, ein Rückwärts-Primer sowie die für die Detektion der Amplifikation nötige TaqMan-Probe.
Auch bei der miRNA-qPCR mit dem interkalierenden Farbstoff SYBR-Green wird zunächst das 3‘-Ende der miRNA verlängert. In diesem Fall hängt man hierzu einfach einen poly-A-Schwanz an das Ende an. An diesen bindet ein Oligo-d(T)-Primer, der zunächst einen miRNA-Duplex herstellt.
Ähnlich wie bei der TaqMan-miRNA-qPCR wird dieser denaturiert und der resultierende Einzelstrang mit einem miRNA-spezifischen Vorwärts-Primer sowie einem Rückwärts-Primer – der an den Poly-A-Schwanz und ein kurzes Stück des ursprünglichen 3‘-Endes der miRNA hybridisiert – amplifiziert. Um einen maximalen Durchsatz zu erzielen, und möglichst viele miRNAs parallel analysieren zu können, führt man die qPCR in der Regel bei beiden Varianten in Multiwell-Platten oder speziellen qPCR-Karten durch.
Die Herstellung von miRNA-Expressionsprofilen mittels Microarrays verläuft im wesentlichen wie bei klassischen mRNA-Microarrays. Die miRNAs werden mit fluoreszierenden Labeln versehen und hybridisieren auf der Oberfläche der Microarrays mit DNA-Proben, die rasterförmig auf den Plättchen angeordnet sind. Anschließend scannt man die Arrays und quantifiziert die Fluoreszenz-Signale, die von den eingefangenen miRNAs ausgehen. Ziemlich clever ist das ebenfalls auf der Hybridisierung von miRNAs an komplementäre Probensequenzen fußende nCounter-System der Firma Nanostring Technologies. Das Konzept des nCounters entwickelte der Systembiologie-Pionier Leroy Hood bereits vor knapp zehn Jahren in seiner Ideenschmiede am Institute for Systems Biology in Seattle.
In den Proben-Kartuschen des Geräts werden die miRNAs mit zwei Hybridisierungs-Proben eingefangen: mit einer Reporter-Probe, an deren Ende ein von Hood ausgedachter Farbcode hängt, der aus sieben Fluoreszenzmolekülen mit vier unterschiedlichen Farben besteht – sowie einer Capture-Probe, die die anvisierte miRNA über eine Biotin-“Kupplung“ an die Oberfläche des mit Streptavidin beschichteten Arrays koppelt.
Da beide Proben mit ihren komplementären Sequenzen an die Ziel-miRNA hybridisieren müssen, ist das System sehr spezifisch. Gleichzeitig ist es durch die zahllosen Kombinationsmöglichkeiten des Barcodes (exakt 47) in der Lage jede einzelne miRNA mit einem separaten Farbcode zu markieren. Das Gerät kann deshalb auch kleinste miRNA-Mengen nachweisen.
Die dritte gängige Variante für die Herstellung von miRNA-Expressionsprofilen ist die miRNA-Sequenzierung, die sich an die etablierten Sanger- sowie Next-Generation-Sequenzierungs-Verfahren für die RNA-Seq anlehnt. Hier stellt man aus der extrahierten RNA zunächst eine cDNA-Bibliothek her, die die kleinen RNAs repräsentiert, und sequenziert diese mit den üblichen NGS-Systemen. Aus der Anzahl der ausgelesenen Sequenzen (Reads) für eine spezifische miRNA im Verhältnis zur Gesamtzahl der Reads ermittelt eine entsprechende Analyse-Software schließlich die Menge der jeweiligen miRNA.
Was nach einem simplen Prinzip klingt, ist in der Praxis äußerst tricky und verlangt sowohl Bioinformatikern als auch den angeschlossenen Recheneinheiten einiges ab. Aus der miRNA-Seq resultiert ein Riesenwust an Sequenz-Fitzeln, die von verschiedenen kleinen RNA-Spezies stammen. Die Kunst der Bioinformatiker besteht letztendlich darin, aus diesem RNA-Schnipselhaufen gezielt miRNAs herauszupicken. Nur wenn dies zuverlässig gelingt, kann die miRNA-Seq ihren größten Trumpf gegen die beiden anderen Methoden ausspielen: die Detektion unbekannter miRNAs, die noch nicht in einer Datenbank erfasst sind.
Bei drei grundlegend verschiedenen Technologien für die Erstellung von miRNA-Expressionsprofilen stellt sich zwangsweise die Frage, welche für den jeweiligen Fall die geeignetste und günstigste ist. Über den Daumen gepeilt, ist die miRNA-Seqenzierung die teuerste aber auch exakteste Methode; miRNA-Microarrays sind günstig, aber eher unspezifisch. Die preislich dazwischen liegenden miRNA-qPCR-Plattformen sind sehr sensitiv und spezifisch. Sie werden deshalb von vielen Forschern favorisiert.
Jo Vandesompele und Pieter Mestdagh von der Universität Ghent wollten genauer wissen, wie groß die Unterschiede zwischen den drei Technologien, und insbesondere auch innerhalb der Plattformen, tatsächlich sind. In einer großangelegten miRNA-Qualitätskontroll-Studie (miRQC) untersuchten sie hierfür einen Querschnitt der derzeit angebotenen Plattformen.
Hierzu schickten die beiden 20 anonymisierte RNA-Proben an zehn Hersteller und gaben ihnen zur Aufgabe, die Expression von mindestens 384 miRNAs mit ihren Plattformen zu analysieren. Die nach den Kriterien Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Spezifität sowie Sensitivität ausgewerteten Resultate der Plattformhersteller trugen Vandesompele und Mestdagh in ein Kreisdiagramm ein. Anhand eines radialen z-Scores veranschaulicht dieses die Güte (Performance) der einzelnen Plattformen, bezogen auf die vier oben genannten Kriterien (Mestdagh et al., Nature Methods, 2014, 11, 809-15).
Einige Ergebnisse der miRQC-Studie überraschten Vandesompele und Mestdagh nicht. So bestätigte sich zum Beispiel die herausragende Sensivität der miRNA-qPCR und die niedrigere Sensitivität von miRNA-Microarrays. Weitaus interessanter sind aber die unerwarteten Ergebnisse der Studie. Hierzu zählen zum Beispiel die generell niedere Spezifität etlicher Plattformen, deutliche Performance-Unterschiede innerhalb der Plattformen sowie eine signifikante inverse Korrelation zwischen der Sensivität und der Spezifität einiger Systeme.
Es empfiehlt sich deshalb, das Paper von Mestdagh et al. vor dem Kauf einer Plattform aufmerksam zu lesen und nach weiteren Vergleichsstudien Ausschau zu halten. Einen aktuellen Vergleich von qPCR-miRNA Plattformen findet man zum Beispiel in der Juni-Ausgabe der Scientific Reports (Farr et al., 5:10375 | DOI: 10.1038/srep10375).
(Erstveröffentlichung: H. Zähringer, Laborjournal 11/2015, Stand: Oktober 2015, alle Angaben ohne Gewähr)
