Immunoassays

Starke Signale

Hubert Rehm

Aus Fernost stammen zwei Meilensteine auf dem Weg zum idealen ELISA, die "Mikro-" und die "Nanokristallmethode".

Immunoassays sind so einfach wie das Schmieren eines Marmeladebrotes. Erst eine Schicht Brot, dann eine Schicht Butter, dann Mangomarmelade oder Pflaumenmus oder Johannisbeer-Gelee. Feinschmecker schließen mit einer Schicht süßem Senf ab. Da empfiehlt sich besonders "Hendlmaier‘s süßer Weisswurstsenf" aus Regensburg. Fragen Sie unseren Wirtschaftsredakteur, der ist Experte beim Hinzugeben von Senf.

Ähnlich beschichten Sie die Wells einer Mikroplatte: Mit Antigen-Antikörper, mit BSA (blocken), mit Antigen etc.. Die oberste Schicht bildet der Nachweis-Antikörper. Er ist markiert: Mit 125Iod, einem Enzym oder Fluoreszenzfarbstoffen. Gelegentlich werden auch mit Fluoreszenzfarbstoffen beladene und mit dem Antikörper beschichtete Latexkügelchen oder Liposomen eingesetzt.

Methoden wie bei EDEKA

Die Auswahl an Nachweisen ist fast so groß wie an Marmeladen bei Edeka. Manche sind gut und teuer, manche billig und schlecht und manche teuer und schlecht. ¹²⁵Iod ist radioaktiv und nicht sehr empfindlich. Bei Enzymen müssen Sie lange inkubieren und Fluoreszenzfarbstoffe neigen zum Quenchen. Deswegen können Sie ihren Nachweis-Antikörper nicht endlos mit Fluoreszenz-Molekülen derivatisieren: Liegen die zu nahe aneinander, kommt es zum Energietransfer und die Fluoreszenz-Emission nimmt ab. Zudem senkt eine exzessive Derivatisierung des Antikörpers seine Affinität. Vier bis acht Moleküle pro Antikörper: mehr geht in der Regel nicht. Mit Fluoreszenzfarbstoffen beladene Liposomen wiederum sind umständlich herzustellen und instabil. Um es mit Wilhelm Busch zu sagen:



Ein rechter Forscher gibt nicht auf

Daher wurden in letzter Zeit weitere Meilensteine auf dem Weg zum idealen ELISA gemeißelt: Zwei davon in Fernost. Eine unerwartete Ecke, aber:



Auch das stammt von Wilhelm Busch, die neuen Nachweismethoden dagegen von Dieter Trau und Reinhard Renneberg. Ersterer forscht in Singapur, letzterer ist seit 1995 Lehrstuhlinhaber in Hongkong. Traus Idee ist vom Ansatz her gut. Über die Praxistauglichkeit kann ich nichts sagen.


Wie wird’s gemacht?

Man mahlt festes Fluorescein-Diacetat (FDA) in SDS zu Mikro-Kristallen von einem Durchmesser von etwa 0,5 mm. Das SDS lagert sich an das hydrophobe FDA an, es bilden sich negativ geladene Partikel (Abb. 1). Auf diese wird, Schicht auf Schicht, erst ein positiv geladener Polyelektrolyt und dann ein negativ geladener aufgetragen. Die entstehenden Partikel sind stark negativ geladen und bilden daher eine stabile Suspension (Kolloid).

An die Partikel werden Antikörper adsorbiert. Diese Antikörper beschichteten Partikel dienen im Immunoassay als letzte Schicht zum Nachweis des Antigens. Der Assay wird wie üblich Schicht auf Schicht mit Binden, Blocken, Waschen entwickelt. Zum Schluß wird der FDA-Kristall mit DMSO/Natronlauge aufgelöst und gleichzeitig das wasserunlösliche FDA in lösliches Fluorescein umgewandelt. Jetzt kann die Fluoreszenz gemessen werden.

Wegen der Verdünnung des Fluoresceins in ein großes Volumen gibt es keine Quench-Probleme. Der Hauptvorteil ist aber das molare Verhältnis von Fluoreszenz-Farbstoff zu Antigen: Bindet ein Antikörper des Partikels an sein Antigen, so hängt am Antigen ein dicker Klumpen FDA aus dem etwa 108 Fluorescein Moleküle entstehen (hundertmillionenfache Verstärkung!). Wegen der Größe der Partikel können auch mehrere Antikörper eines Partikels binden. Das setzt die Verstärkung entsprechend herunter, erhöht aber die Affinität der Partikelbindung. Dieser Mikrokristall-Nachweis soll 70- bis 2000- mal sensitiver sein als Assays in dem der Fluoreszenzfarbstoff direkt und kovalent an den Antikörper gebunden wurde (Anal. Chem. 2002, 74, 5480-5486).

Leider haben Renneberg und Trau die Sensitivität nur mit einem Einfachst-System nachgewiesen: Sie beschichteten ihre Mikroplatten mit Ziegen-anti-Maus-IgG, gefolgt von Verdünnungen von Maus-IgG als Antigen und schließlich den mit Ziegen-anti-Maus-IgGs beschichteten Mikrokristallen. Aber selbst in dem Simpel-System scheinen die Mikro-Kristalle nicht restlos überzeugt zu haben, denn zwei Jahre später erschien ein Nachfolge-Artikel in Anal. Chem. (76, 3638-3645).



Es geht noch besser

Statt Mikro-Kristallen werden Nano-Kristalle verwendet (Durchmesser 107 nm), ganz nach dem chinesischen Sprichwort:



Zudem wurde die Beschichtung vereinfacht. Statt den FDA-Kristall sukzessive mit SDS, positivem bzw. negativem Polyelektrolyt zu beschichten, wird der Kristall nur mit einem Phospholipid-PEG-Derivat beschichtet (Abb. 2). Die hydrophoben Acylreste lagern sich an das FDA an, das hydrophile PEG richtet sich ins Medium aus. Statt also erst Butter, dann Marmelade und schließlich Senf schichtweise aufs Brot zu schmieren, rühren Renneberg und Genossen Butter, Marmelade und Senf zusammen und tragen von der apettitlichen Mischung nur eine Schicht auf. Das spart Arbeit und zudem sei die Ladungsdichte niedriger als bei der vorigen Methode, was zu einer niedrigeren unspezifischen Bindung führe.

An die negativ geladenen Partikel werden die Antikörper adsorbiert. Bindet ein Partikel an ein Antigen, so markiert er das Antigen mit zwei bis drei Millionen Fluorescein-Molekülen. Immer noch ein millionenfache Verstärkung.

Renneberg und Trau wollen mit ihren Nano-Partikeln eine 400- bis 2700-fach höhere Sensitivität erreicht und die Detektionsgrenze 5- bis 28-fach nach unten verschoben haben (im Vergleich zu Immunoassays mit direkt an die Antikörper gebundenen fluoreszierenden Molekülen).

Sie wundern sich über den Widerspruch zwischen millionenfacher Verstärkung und nur tausendfach höherer Sensitivität? Nun, die Grenzen der Methode liegen nicht im Verstärkungsfaktor, sondern in der Qualität der Antikörper. Mit mäßig spezifischen, niedrigaffinen Antikörpern wird auch die höchste Verstärkung nur miese Signale geben. Die unspezifische Bindung wird ja auch millionenfach verstärkt: Trau, schau wem! (deutsch-chinesisches Sprichwort).


Nur geklebt, nicht getackert:

Das Phospholipid-PEG-Derivat adsorbiert an das FDA, der Antikörper an Phospholipid-PEG-Derivat. Könnte man bei kovalenter Bindung von Antikörper und Phospholipid-PEG-Derivat stringenter waschen und so eine bessere Spezifität erreichen?

Nein, sagt Matthias Seydack von der Biognostic AG (Renneberg ist Vorstandsvorsitzender). Die Spezifität verbessere sich nicht durch kovalente Bindung des Antikörpers. Es bestünde vielmehr die Gefahr zunehmender Aggregation. Auch erreichten sie mit dem Test in punkto Sensitivität/Detektionslimit zwar eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Fluoreszenzimmunoassays, nicht aber gegenüber ELISAs.

Sie werden sich auch fragen, warum man sich solche Mühe mit diesen banalen Immunoassays gibt? Nun: Der Reiz der Immunoassays liegt im Finanziellen. Immunoassays werden in klinischen Labors im Großmaßstab durchgeführt. Jedes Patent, das sich dort durchsetzt, kann Millionäre zeugen.

Letzte Änderungen: 10.06.2005