Dušan Garić und seine Chefin Suhad Ali bei einem Fast Semi-Dry WesternBlot. Nachdem Garić endlose Nächte mit dem Herstellen von Western Blots verbrachte, wollte er die Blotdauer zumindest ein Stück weit verkürzen. Da ihm die kommerziellen Puffer für den schnellen Semi-Dry Western Blot zu teuer waren, entwickelte er seine eigenen.
Zeit ist auch im Labor Geld. Mit wenig Aufwand lässt sich die Transferdauer beim Semi-Dry Blotten erheblich verkürzen.
Der Transfer von Proteinen oder Nukleinsäuren aus einer Gelmatrix auf eine Membran ist gängige Praxis in biowissenschaftlichen Laboren. Vom englischen Wort „Blot“ für Klecks oder Fleck abgeleitet, sprechen Laborianer von einem Blot oder Blotten. Edwin Southern stellte 1975 den Transfer von DNA auf eine Membran vor, daraus wurde schnell der Southern Blot. Kurze Zeit später tauchte der Begriff Northern Blot für den RNA-Transfer auf und 1979 war der Western Blot an der Reihe, bei dem Proteine geblottet werden.
Beim Western Blot überträgt man die in einem Gel aufgetrennten Proteine auf eine Membran und identifiziert die gesuchten Proteine mit Antikörpern, die an die immobilisierten Proteine binden. Bei der einfachsten Western Blot-Variante fließt eine Pufferlösungen aus einer feuchten Lage Papier in Richtung einer trockenen Papierschicht. Zwischen den Papierlagen befindet sich die Gelmatrix und die Blotmembran. Die zu transferierenden Moleküle lösen sich im Puffer und fließen in dessen Strom passiv mit, bis sie von der Membran festgehalten werden. Der Transfer dauert auf diese Weise jedoch ziemlich lange und die Stärke des Flusses reicht nicht aus, um alle Moleküle gleichmäßig aus dem Gel auf die Membran zu übertragen.
Daher platziert man die Packung aus Puffer-getränkten Filterpapierstreifen, Gel und Membran zwischen zwei Platten-Elektroden und legt eine Spannung an. Da die Filter hierbei feucht aber nicht pitschnass sein sollten, spricht man von Semi-Dry Blotten. Das elektrische Feld zieht die geladenen Moleküle aus der Gelmatrix auf die Membran. Je nach deren Beschaffenheit aus Nylon, Nitrozellulose, Glasfaser oder Polyvinylidenfluorid (PVDF), werden die Moleküle durch hydrophobe oder ionische Wechselwirkungen von der Membran zurückgehalten und am Weiterwandern gehindert.
Dušan Garić von der Universität in Montreal dauerte die Transfer-Zeit beim Semi-Dry Verfahren, die meist bei 45 bis 90 Minuten liegt, zu lange. Er experimentierte mit verschiedenen Puffersystemen und variierte die Pufferzusammensetzung, um die Blotdauer auf 12 Minuten zu verkürzen (Garic et al., Analytical Biochemistry 441, 182-4).
Die Zusammensetzung des Blot-Puffers spielt eine wesentliche Rolle beim Proteintransfer. Ein klassischer Western-Puffer ist der Bjerrum Schaefer-Nielsen oder kurz BSN-Puffer, der Tris, Glycin und Methanol enthält. Methanol aktiviert die Membran, Glycin ist durch seine Ladung ein sehr beliebtes Laufmittel und Tris ist eine gängige Substanz zur pH-Wert-Stabilisierung. Der pH-Wert des Puffers beeinflusst das Verhalten der Proteine im elektrischen Feld ganz entscheidend. Ein Beispiel sind Sammel- und Trenngelpuffer bei der SDS-PAGE, die durch unterschiedliche pH-Werte von 6,8 beziehungsweise 8,8 die Ladung des Glycins verändern. Bei pH 6,8 ist Glycin ungeladen, bei pH 8,8 geladen.
Garić und seine Kollegen variierten den BSN-Puffer, indem sie zu Tris weitere Chemikalien mit Pufferwirkung zusetzten. Hierbei testeten sie folgende Reagenzien: HEPES, Tricin, Diglycin, HEPPS/EPPS, Bicin und TAPS in aufsteigenden Konzentrationen von 10 bis 40 mM. In allen Varianten betrug der pH-Wert 8 bis 9. Proteine wandern am effektivsten aus dem Gel heraus, wenn der pH-Wert 10 bis 15 % über dem durchschnittlichen isoelektrischen Punkt der Proteine liegt.
Als Test-Blotsystem diente den Kanadiern der Transfer eines Proteinstandards aus einem 10 % Gel auf eine Nitrozellulose-Membran. Die Stromstärke stellten sie auf 375 mA ein, die Übertragungsdauer beschränkte die Gruppe auf 12 Minuten.
Mit dem klassischen BSN-Puffer reichte diese kurze Zeit nicht aus, um auch die „fetten“ Proteine mit Molekulargewichten von 150 kDa bis 250 kDa zu übertragen. Die Gruppe ergänzte deshalb einen 48 mM Tris-Puffer mit verschiedenen Konzentrationen der oben genannten Puffersubstanzen und verwendete diese Kombinationspuffer für das Fast-Blot-System. Die vielversprechendsten Blotergebnisse lieferten Puffer mit zusätzlichen 20 mM HEPES /25 mM Tricin /25 mM Diglycin /15 mM HEPPS/EPPS / 20 mM Bicin oder 30 mM TAPS.
Das Rennen machten schließlich die Kombinationspuffer mit 48 mM Tris und 20 mM HEPES oder 48 mM Tris und 15 mM HEPPS/EPPS, mit denen sich auch 150 kDa bis 250 kDa schwere Proteinbrocken innerhalb von 16 Minuten auf die Blotmembran transferieren ließen. Für die kleineren Proteine reichten mit diesen Puffermischungen bereits 12 Minuten für den vollständigen Transfer aus.
Im Grunde genügt der durch Kapillarkräfte im Papier ausgelöste Puffer-Fluss, um Proteine aus der Gelmatrix auf die Western-Blot-Membran zu transportieren. Ein elektrisches Feld beschleunigt den Vorgang beim Semi-Dry-Blotten jedoch erheblich. Noch schneller verläuft der Protein-Transfer, wenn der Puffer optimiert ist.
Diesen beiden Puffern setzte die Gruppe drei weitere Komponenten zu und benutzte die Puffer für die nächsten Semi-Dry Western Blot-Experimente. Die Zutaten waren: Natriumbisulfit (1,3 mM Endkonzentration), EDTA (1 mM) und N,N-Dimethylformamid (1,3 mM). Die drei Substanzen wählte die Gruppe nicht zufällig aus. Sie machen insbesondere Sinn, wenn die Elektrophorese des Proteingemisches unter nativen Bedingungen stattgefunden hat, also ohne denaturierende Reagenzien wie SDS oder Dithiotreithol (DTT). Natriumbisulfit wirkt reduzierend und verstärkt die Ladungseigenschaften von Proteinen im elektrischen Feld. Außerdem erhöht es die Löslichkeit von großen Proteinen, die ohne SDS zur Präzipitation neigen, was dem Proteintransfer auf die Membran nicht gerade förderlich ist. Zudem fängt es freie Radikale ein, die durch den Einsatz von HEPES oder HEPPS/EPPS in der Lösung entstehen.
EDTA bindet Metallionen und baut sie in einen stabilen Chelat-Komplex ein. N,N-Dimethylformamid schließlich ist eine chaotrope Substanz, die Molekül-Wechselwirkungen, etwa Wasserstoffbrückenbindungen, zerstört und dadurch die Unordnung zwischen den Molekülen verstärkt. Auch dies erhöht letztlich die Löslichkeit der Proteine und damit deren „Transferbereitschaft“.
Als optimale Puffer für den kanadischen Fast-Blot blieben schließlich zwei Fast Semi-Dry Transfer Puffer, kurz FSDT-Puffer übrig: 48 mM Tris mit 20 mM HEPES und 48 mM Tris mit 15 mM HEPPS/EPPS sowie 1 mM EDTA, 1.3 mM Natriumbisulfit und 1.3 mM N,N-Dimethylformamid.
Laut Dušan Garić, sollte man die EDTA-Lösung aus einer 500 mM Stocklösung (siehe Sambrook und Maniatis) herstellen und dann frisch zugeben. Das gleiche gilt auch für die Natriumbisulfitlösung, die man durch einfaches Verdünnen einer 500 mM Lösung kurz vor der Zugabe herstellt.