Vom Protein auf die DNA rückschließen?
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Dass DNA-Abschnitte für Proteine codieren, ist hinlänglich bekannt. Aber dass Proteine für DNA-Abschnitte codieren? Unvorstellbar. Von der Aminosäuresequenz kann man auf jeden Fall nicht auf die codierende DNA-Sequenz rückschließen, da der genetische Code degeneriert ist.
Aber was wäre, wenn ein Protein eine ähnliche Codon-Struktur annehmen würde wie die DNA, wobei nicht ein Triplett einer Aminosäure, sondern zwei Aminosäuren einem Nukleotid zugeordnet sind?
Verkehrte Welt. Aber genau das gibt es. Vor wenigen Jahren fanden Forscher in pflanzenpathogenen Xanthomonas-Arten Proteine, die bei Infektion an die DNA der Wirtspflanze binden und die Expression von Genen bewirken, die das Infektionsgeschehen positiv beeinflussen – aus der Sicht von Xanthomonas, versteht sich (Ann Rev Phytopathol 48: 419-36).
Um zu verstehen, wie das funktioniert, muss man sich vor Augen führen, wie die Größenverhältnisse von Proteinen und DNA sind. Ein Basenpaar hat eine Molekülmasse von etwa 660 Da. Drei dieser Basenpaare, also etwa 2 kDa, codieren für eine Aminosäure. Da jede Aminosäure aber nur mit durchschnittlich 110 Da zu Buche schlägt, bedeutet das, dass ein Protein deutlich kleiner ist als die codierende DNA-Sequenz.
So kann man sich auch vorstellen, dass ein Proteinabschnitt für eine Base „codiert“. Und genau so ist es bei Xanthomonas: Die DNA-bindenden Proteine bestehen aus Modulen, die aneinandergereiht eine bestimmte DNA-Sequenz erkennen. Sie heißen transcription-activator like effectors (TAL effectors). Ein TAL besteht typischerweise aus 13 bis 28 Modulen, und jedes Modul besteht aus 34 Aminosäuren. 32 dieser Aminosäuren sind hoch konserviert, nur die Positionen 12 und 13 variieren.
Die Aminosäuren an diesen beiden Positionen entscheiden darüber, an welches Nukleotid das Modul bindet. Dabei ist die Spezifität zwar nicht absolut, aber sehr hoch: Das Dimer Histidin/Asparaginsäure bindet beispielsweise an Cytosin, Asparagin/Glycin an Thymin. Ein gutes Dutzend dieser codierenden Aminosäurepärchen (repeat-variable di-residues, RVDs) sind bisher identifiziert – manche kommen häufiger vor, manche seltener, manche sind spezifischer, manche weniger. Das Gute daran: Sie funktionieren überall, nicht nur bei Pflanzen.
Die Struktur des Komplexes aus TAL-Effektor und DNA konnte kürzlich von einem Team um Barry Stoddard vom Fred Hutchinson Cancer Research Center in Seattle aufgeklärt werden (Science 2012, 335(6069):716-23). Und tatsächlich: Die RVDs stehen direkt mit den einzelnen Nukleotiden des DNA-Stranges im Kontakt.
Bisher waren zwar viele DNA-bindende Proteine bekannt, man konnte sie aber nicht nach eigenen Wünschen gestalten und an bestimmte DNA-Sequenzen anpassen – man musste das nehmen, was da war. Mit den TAL-Effektoren braucht man nur noch die entsprechenden Module nach den eigenen Wünschen aneinanderzureihen und erhält ein Protein, das jede gewünschte DNA-Sequenz bindet.
Wenn der findige Gentechniker nun noch ein Enzym anhängt, kann er theoretisch alles tun, was ihm beliebt. Ein solches Enzym ist die Nuklease Fok1, die Doppelstrangbrüche generiert. Fok1 funktioniert als Dimer, so dass man zwei verschiedene TAL-Effektoren mit jeweils fusionierter Fok1 benötigt, die, von entgegengesetzten Seiten kommend, an die beiden DNA-Stränge binden – in der Mitte bilden sich Fok1-Dimere und schneiden den Doppelstrang durch. Das Ganze nennt sich dann TAL-Effektor-Nuklease (TALEN). Das eine Konstrukt erkennt und bindet die Sequenz upstream der gewünschten Schnittstelle und das andere die Sequenz downstream, wodurch sich die Spezifität zusätzlich erhöht.
Doppelstrangbrüche repariert die Zelle entweder durch notdürftiges Flicken (non-homologous end joining, NHEJ), oder, eleganter, durch homologe Rekombination. An dieser Stelle kann man ein verändertes Template einschmuggeln – wie bei der herkömmlichen gezielten Mutagenese der chromosomalen DNA durch homologe Rekombination auch.
Noch steckt die Methode in den Kinderschuhen: Doch im Idealfall ist es möglich, das Genom einzig und allein an der gewünschten Stelle zu verändern, ohne lästige Marker und Kassetten.
Das Forschungsfeld explodiert gerade nahezu. Von Saccharomyces bis Arabidopsis, von Zebrafisch bis hin zu menschlichen embryonalen Nierenzellen, alles, was in Reichweite eines TAL-Effektor-Gentechnikers kommt, wird mit TAL-Effektoren behandelt. Entweder transfiziert der Forscher sein Versuchsobjekt mit einem Plasmid, auf dem beispielsweise ein TALEN-Fusionsprotein codiert ist, oder er injiziert direkt mRNA. Die publizierten Erfolgsraten sind hoch, mehrere Prozent der so behandelten Zellen weisen die gewünschten Mutationen in den anvisierten DNA-Abschnitten auf. Gleichzeitig scheinen die Zellen die TAL-Effektoren gut zu vertragen, und die Spezifität ist extrem hoch.
Was bringt die Zukunft also? Vorstellen kann man sich alles, was das Herz eines Molekularbiologen höher schlagen lässt: Neben der Mutagenese könnte man die Expression einzelner Gene gezielt verstärken oder hemmen, oder durch die Fusion mit Methyltransferasen oder Histondeacetylasen die epigenetische Ausstattung der Zellen verändern.
Eines zumindest scheint klar. TAL-Effektoren haben das Zeug dazu, unsere Arbeit in ähnlicher Weise zu revolutionieren wie einst die Erfindung der PCR.