Von lästigen Artikeln und penetranten Autoren

Dass neue Ergebnisse ein bereits publiziertes Paper widerlegen, gehört zum Kern der wissenschaftlichen Methode. Doch versuchen Sie mal ein solches "Refutation Paper" zu veröffentlichen. Oftmals meiden Editoren solche Artikel wie der Teufel das Weihwasser.

(19.10.2006) Journal-Editoren haben es schwer. Die Zeitschrift macht ihnen viel Arbeit, das große Geld verdienen andere damit. Wenigstens bleibt dem Editor die Ehre. Die aber ist ständig in Gefahr, da sie parallel mit dem Ansehen des Journals steht und fällt. Und dieses wiederum hängt ab von der Qualität der darin publizierten Artikel, zumindest der scheinbaren Qualität. Klar daher, dass Journal-Editoren alles meiden, was dem Ansehen bereits veröffentlichter Artikel schaden könnte.

Allein dies erklärt schon den Widerwillen von Journal-Editoren, "Refutation Papers" zu veröffentlichen -- Papers also, die einen bereits früher publizierten Artikel des Journals inhaltlich widerlegen. Da solche Artikel in der Regel außer der Vernichtung des früheren Papers nichts Neues bieten, handelt es sich meist um eine Nullrunde: Das alte Ergebnis ist dahin, ein Neues gibt es nicht. Nichts gewesen außer Spesen, und einem Haufen bedruckten Papiers.

Wenn es sich zudem um ein hochrangiges Journal handelt, wie Science, Nature oder Cell, dann beschleicht den Editor schnell die Vermutung, es wolle sich einer den Zugang zu deren illustren Seiten erzwingen: Das Ergebnis A, wenn es denn gestimmt hätte, erschien zurecht in Science, Nature oder Cell, dessen Verneinung ist nun aber banal - und Banalitäten haben in exquisiten Journalen nichts zu suchen. Schon deshalb nicht, weil sie voraussichtlich wenig Zitate einbringen, also den Impact-Faktor des Journals drücken und damit das Ansehen des Editors. Ja, gerade Editoren schielen besonders auf Impact-Faktoren!

Zudem will der Angegriffene voraussichtlich antworten, worauf der Angreifer wieder antwortet etc: Eine Flut von bedrucktem Paper würde die Forschergemeinde darauf aufmerksam machen, dass nicht einmal Science, Nature oder Cell unfehlbar sind. Und mal ganz abgesehen von den Lesern: Was sollen die Eigentümer, die Verleger denken? Keine Frage, "Refutation Papers" müssen Ehre und Ansehen des Editors unterspülen.

Was geschieht also in solchen Fällen? "Soll der das doch anderswo veröffentlichen. Am besten in einem Journal, das keiner liest", denken Editoren dann oft. Und so kommt es, dass der Editor desjenigen Journals, in dem der widerlegte Artikel erschienen ist, die nachfolgende Widerlegung in der Regel ablehnt.

Der Autor der Widerlegung ist natürlich anderer Meinung: "Wenn Behauptung A gut genug war, um in der Zeitschrift veröffentlicht zu werden, dann muss auch die Widerlegung von A gut genug für die Zeitschrift sein." Es ginge ja nicht an, dass ein Journal sich erst im Glanz eines vermeintlich sensationellen Ergebnisses sonnt, und dann einfach wegschaut, wenn es sich als falsch herausstellt. Immerhin wurde die Leserschaft einer bestimmten Zeitschrift irregeführt, also sollte auch genau diese Leserschaft Ziel der Richtigstellung sein. Schließlich könne die Wirkung einer falschen Behauptung in Science wohl kaum durch eine Widerlegung in Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie korrigiert werden.

Und solche Wirkungen können durchaus beachtlich sein: Dutzende von Doktoranden werden womöglich monatelang auf den Holzweg gelockt. Bisweilen werden auf der Basis fehlerhafter Veröffentlichungen sogar Diagnostika entwickelt.

So ähnlich dachten vor einiger Zeit auch Forscher des Instituts für Experimentelle Pathologie/Molekulare Neurobiologie an der Universität Münster. Jürgen Brosius und sein Team befanden damals die Ergebnisse einer Studie im Journal of Clinical Investigation aus dem Jahr 1997 als wenig stichhaltig - Titel: "Characterization of the AD7C-NTP cDNA Expression in Alzheimer's disease and measurement of a 41-kD protein in Cerebrospinal fluid" (J. Clin. Invest. 100: 3093-3104). Erstautor de la Monte et al. hatten dafür eine cDNA Bank aus einem Alzheimer-Hirn mit polyklonalen Antikörpern gegen menschliches thread protein aus dem Pankreas (MTPP) gescreent. Dabei fanden sie (warum auch immer) die nicht zu MTPP homologe cDNA eines neuronal thread proteins (NTP). Und laut den Autoren soll nun dieses NTP mit den Tau-Proteinen kolokalisieren, die an der Bildung der paired helical filaments in Alzheimer-Hirnen beteiligt sind.

Das Problem von de la Monte et al.: Ihre NTP- cDNA stimmt laut Brosius und Kollegen nicht zu 100% mit dem entsprechenden Locus im Genom überein. Außerdem besteht der Genort aus vier Alu-Elementen, die zu den Retroposons gehören und sich über einen Copy/Paste Mechanismus im Genom vermehren. Alu-Elemente finden sich daher, oft ineinander verschachtelt, in über 1 Million Kopien im menschlichen Genom -- meist in nicht kodierenden Abschnitten, der sogenannten "Junk"-DNA. Oft sitzen sie auch in Introns und intergenischen Bereichen und tauchen daher gelegentlich ebenfalls in nicht-translatierten, seltener auch in translatierten Abschnitten von mRNAs auf, wie die Münsteraner selbst schon mehrmals zeigen konnten.

De la Monte et al. hätten demnach einen extrem seltenen Fall beschrieben -- ein komplett aus "Müll" entstandenes Gen. Nach den Autoren kodiert der genomische Locus für ein Protein mit einem Molekulargewicht von 41 kD, eben das NTP. Die NTP-mRNA soll nun im Alzheimer-Hirn konstitutiv erhöht sein. Desweiteren liege die Konzentration von NTP in der Cerebrospinal-Flüssigkeit von Alzheimer Patienten höher als bei gesunden Altersgenossen. Dies gelte sogar für Leute im Anfangsstadium von Alzheimer, weshalb NTP durchaus diagnostischen Wert habe.

Von den acht Autoren des de la Monte-Papers sind vier als Mitarbeiter der US-Firma Nymox ausgewiesen. Dort wurde auf der Grundlage der Erkenntnisse von de la Monte et al. -- sowie einer Reihe darauf aufbauender Folge-Publikationen -- ein sogenannter 7c Gold Test entwickelt. Dieser erlaube angeblich über den Nachweis von NTP im Urin eine zu 90% sichere Diagnose von Alzheimer. Nymox entwickelte den 7c Gold Test nachfolgend zum AlzheimAlert-Test weiter, der ebenfalls über den Nachweis von NTP im Urin die Früherkennung von Alzheimer ermöglichen soll.

Die Münsteraner bezweifeln nun vor allem die genetische Grundlage des Proteins, das der Test detektiert: Der Vergleich der DNA-Sequenz von de la Monte et al. mit der entsprechenden humanen Genomsequenz zeigt zahlreiche Basen-Fehlpaarungen sowie kleinere Insertionen und Deletionen. Diese führen zu einer Verschiebung des Leserahmens und damit zu frühzeitigen Stopp-Codons. Der offene Leserahmen ende nach den Münsteranern bereits nach 98, statt nach 375 Basentripletts bzw. Aminosäuren, wie von de la Monte beschrieben. Dies ergäbe ein Protein von 11-12 kD, und nicht eines von 41 kD. Brosius und Co. folgern daher, dass es sich dabei wohl kaum um ein zusätzliches Allel handeln könne, das bei Alzheimer aktiviert wird: Kontrollen, die laut de la Monte et al. ein schwaches NTP-Signal aufweisen, dürften in diesem Falle überhaupt kein 41 kD NTP besitzen. Würde es sich dennoch um ein solches Alzheimer-gekoppeltes Allel handeln, so könnte man dies leicht über genomische PCR und verschachtelte RT-PCR bereits beim gesunden Menschen nachweisen und bräuchte keinen AlzheimAlert-Test.

Die Münsteraner argumentieren weiter, dass die Northern Blot-Analyse mit den verwendeten Sonden aufgrund der Alu-Sequenzen einen Schmier statt einer Bande ergeben müsste (de la Monte et al. zeigen keinen Northern Blot).

Das Argument, dass Antikörper gegen das rekombinante 375 Aminosäure-Protein im Western Blot ein Protein von Kd erkennen, beeindruckt die Münsteraner auch nicht: Ein Antikörper gegen eine von Alu-Elementen kodierte Aminosäuresequenz müsse immer etwas erkennen, da bei Primaten viele Exons eine Alu-Sequenz enthalten und diese daher auch translatiert werden sollten. In der Tat erkennt der Antikörper auf dem Western Blot nicht nur ein Protein bei 41 Kd, sondern eine ganze Reihe anderer, teilweise gar mit höherer Intensität.

Kurzum: Das dreiseitige Refutation-Paper der Münsteraner Forscher zerreißt die zwölf Seiten von de la Monte et al. zu Konfetti. Das Manuskript schickten sie im September 2004 logischerweise ans Journal of Clinical Investigation (JCI), in dem die Arbeit von de la Monte et al. sieben Jahre zuvor erschienen war.

Die Antwort kam einige Tage später und lautete sinngemäß: "Veröffentlichung im JCI zu dieser Zeit nicht angemessen. Hält dem Vergleich mit anderen Arbeiten nicht stand. Vielen Dank." Die Widerlegung des ehemals publizierten Papers war dem JCI also offenbar das Papier nicht wert.

Daraufhin wandten sich die Münsteraner an Biochimica et Biophysica Acta (BBA). Der Grund: BBA veröffentlicht schnell, zudem passte das Manuskript gut in die Sparte "Gene Structure and Expression" des Journals. In der Tat leitete BBA die Richtigstellung umgehend an drei Referees weiter. Deren Kommentare waren heterogen. Referee 1 war sichtlich erzürnt und sprach über eine volle Seite hinweg vom Vergleich von Äpfel mit Birnen, von fehlerhafter Kritik und von "broad and sweeping generalizations". Referee 2 schrieb: "I believe that the reviewed manuscript is interesting, important and reasoned" und hatte ansonsten nur einige Kleinigkeiten auszusetzen. Referee 3 schließlich beurteilte das Manuskript von Kriegs et al. mit dem einzigen Satz: "This is a very, very strong paper." Die Kommentare von Referee 1 konnten die Münsteraner leicht auskontern, worauf das Paper in BBA (Vol. 1727: 1-4) erschien.

Das ist schön. Aber: Studieren die Leser des JCI auch BBA? Und: Was wird die Firma Nymox tun? Zieht sie ihren 7c Gold Test zurück?

Auf eine Anfrage bei Nymox kam als Antwort eine Werbebroschüre. Zurück ging eine Beschwerde. Daraufhin rief ein leitender Angestellter von Nymox an und versprach, einen Kommentar zu schicken. Hier ist er (in gekürzter Form):

"There are two parts to the Kriegs paper: 1) genomic sequence theoretical analysis which is legitimate and 2) inferences about a medical test (NTP test) which are uninformed and completely incorrect.

Concerning 1) we do not take issue with the analysis of the Kriegs paper at this point in time, although it is an evolving area and will likely continue to change.

Concerning 2), the medical test does not rely at all upon any gene analysis, Kriegs or otherwise. The medical test simply measures the quantity of a substance (regardless of its ultimate exact structure), and is based on decade-long research using tangible and real materials from actual brain tissue and actual patient samples of spinal fluid and urine. There are over 20 peer-reviewed published studies describing these tangible and real materials and research using them.

More importantly, many double-blind independent clinical studies have shown that the AlzheimAlert test has a sensitivity of 89% and a specificity of over 90% in distinguishing AD from non-AD."

Wie dem auch sei: Brosius & Co. haben nie behauptet, dass der Test nicht irgendetwas detektiert. Sie bezweifeln lediglich, dass er das NTP Protein nachweist.

Mit ihrer Richtigstellung jedoch sind sie noch vergleichsweise gut weggekommen: Das Manuskript hatten sie in zwei Wochen geschrieben und nach einer Ablehnung wurde es schon gedruckt. In der Regel ist die Durchsetzung einer Richtigstellung jedoch eine Sisyphusarbeit und so undankbar wie ein Loch im Socken.

Auch dazu ein Beispiel. 1996 publizierten Janine LaSalle und Marc Lalande ein Paper mit dem Titel "Homologous association of oppositely imprinted chromosomal domains" (Science 272, 725-8). Die Aussage war: Die geprägten (imprinted) Regionen des Prader-Willi Syndroms auf den beiden Chromosom 15 assoziieren während der späten S-Phase. Romantisch ausgedrückt: Die Chromosomen küssen sich in der Region 15q11-13. Dieser "Kuss", so LaSalle und Lalande, sei notwendig für den Prägestatus.

Das LaSalle-Paper wurde (und wird) über dreistellig zitiert; der "Kuss der Chromosomen" wird seitdem von manchen als fundamentaler epigenetischer Prozess betrachtet.

Auch die Gruppe um den Humangenetiker Thomas Cremer von der LMU München, ausgewiesener Zellkernarchitektur-Forscher, fand das LaSalle-Paper interessant. So interessant, dass sie selbst eine Methode entwickelte, mit der man den Abstand zwischen bestimmten Chromosomenabschnitten zuverlässig bestimmen konnte. Mit der Hilfe von Bernhard Horsthemke, einem Imprinting-Spezialisten von der Uni Essen, prüfte Cremers Diplomandin Kathrin Teller die Angaben von Janine LaSalle.

Das Ergebnis (E-Mail-Zitat Cremer): "Küssen" spielt jedenfalls beim Imprinting keine Rolle. Zwar liegen die beiden PWS/AS-Loci in der späten S-Phase tatsächlich etwas näher beisammen als in der frühen S-Phase, aber von der intimen Nähe, die man zum Küssen nun einfach mal braucht, kann hier nicht die Rede sein. Wichtiger, wir konnten nachweisen, dass der von uns beobachtete Effekt mit den PWS/AS Loci nichts zu tun hat, sondern vermutlich etwas mit den Nukleolus Organisator Regionen (NORs), die auch auf den menschlichen Chromosomen 15 kartieren. Beim Gorilla nämlich, der ebenso wie wir auf den entsprechenden homologen Gorilla Chromosomen PWS/AS-Loci besitzt, jedoch keine NORs, war keinerlei Näherung der PWS/AS-Loci während der S-Phase zu beobachten. Aber der Imprinting-Mechanismus funktionierte auch in diesen Zellen, wie das Team von Bernhard Horsthemke zeigen konnte."

Am 31. August 2004 reichte Cremer sein Manuskript mit dem Titel "Kissing not required for maintenance of imprinting in cycling human cells" bei Science ein -- dem Journal also, das den richtig zu stellenden Artikel veröffentlicht hatte. Wie schon Kriegs et al. schaffte es auch Cremers Werk nicht einmal in den Review-Prozess: "Because your manuscript was not given a high priority rating during the initial screening process, we will not be able to send it out for in-depth review. Although your analysis is interesting, we feel that the scope and focus of your paper make it more appropriate for a more specialized journal."

Im Gegensatz zu Kriegs et al. gab Cremer nicht auf. Er bat den Editor, seine Entscheidung zu überdenken, und legte die Gründe auf vier (!) engbeschriebenen Seiten dar.

Die Antwort von Science war kürzer (1/2 Seite). Editor Guy Riddihough ging nicht auf Cremers spezifische Argumente ein, sondern brachte Allgemeines vor: Das LaSalle-Paper sei schon acht Jahre alt, die Refutation nicht "of urgent broad general interest", und überhaupt müsse man eben eine Auswahl treffen.

Cremer wandte sich darauf an den Chief Executive Editor von Science, Alan Leshner. Er bat, seine Widerlegung wenigstens reviewen zu lassen und schrieb: "I am however, deeply concerned with an editorial practice that in essence states, we pick what we want to print and if a paper turns out to be wrong we do not care to publish evidence against it, if our interest has changed in the mean time. Und weiter: The fact that the claims of this paper (LaSalle et al.) have survived now for eight years without serious scrutiny makes the publication of evidence to the contrary in my opinion even more urgent."

Die Ablehnung kam anderen Tags vom Deputy Editor: Seit dem LaSalle-Paper sei schon zu viel Zeit ins Land gegangen.

Cremer hatte inzwischen den Eindruck gewonnen, er gelte im Editorial office von Science als Querulant. Dennoch hielt ihn das nicht ab, dem Deputy Editor zu antworten. Ein Auszug: "I believe that time alone is not a convincing argument to deny a peer review and, depending on the outcome, publication of unequivocal evidence against a hypothesis with far reaching consequences in the same journal where this hypothesis was first published. In case that the unhappy hypothesis has already been murdered by a "gang of brutal facts" (as Benjamin Franklin put it) it is certainly not of high interest to provide space in Science (...) May be this is the case with repect to the 1996 paper of LaSalle and Lalande. May be it is not. (...) If a peer review yields the verdict that our "negative" experimental evidence is impeccable, but that our data are an overkill of a hypothesis already dead as a dodo for many years, I will accept such a judgement with no complain."

Auf den Deputy Editor machte das keinen Eindruck. Er wischte Cremers Argumente mit ein paar Floskeln zur Seite.

An Science verzweifelnd erkundigte sich Cremer daraufhin bei Nature Cell Biology, ob er sein Manuskript einschicken dürfe. Die Antwort war zwar im Sinne von Cremer, brachte ihn aber nicht weiter: "Given that this data in the first instance refutes a Science paper from 1996, it seems that this journal ought to take an interest in setting the record straight."

Doch siehe da, im Juni 2005 erschien ein Artikel von Spilianakis et al. in Nature (Vol. 435: 637-645). Auch hier schrieben die Autoren über die räumliche Annäherung zwischen zwei Chromosomen. Im begleitenden "News&Views"-Artikel wurde gefragt: "Are inter- and intrachromosomal associations a general phenomenon occurring in all types of cells or not?"

Nun war das genau die Frage, zu der Cremer schon eine Weile etwas sagen wollte. "Offensichtlich besteht doch Interesse an dem Problem", dachte er und setzte unter Verweis auf das Spiliakis-Paper bei Nature Cell Biology nach. Die waren jetzt immerhin bereit, das Manuskript zu lesen. Einen Monat später lehnten sie es dennoch ab, ohne damit einen Reviewer belästigt zu haben.

Cremer hatte es inzwischen auch noch einmal bei Science probiert. Der Hinweis auf Spiliakis et al. sowie zusätzliche Resultate, so hoffte er, müssten die doch weichkochen. Aber Science blieb hart.

Nun schickte Cremer das Manuskript an Nature. Auch hier wurde es abgelehnt: "…as it pertains to a paper that was published elsewhere."

Wenig später erschienen in Science und Nature Cell Biology zwei Paper (Xu et al., Science 311: 1149-52, and Bacher et al., Nature Cell Biology 8:293-9) die behaupteten, für den X-Inaktivierungsprozess sei ein kurzer Kontakt zwischen den X-Chromosomen notwendig. Beide Paper verwiesen auf das LaSalle-Paper. Zudem erschien in Science zum Xu-Paper ein Kommentar, in dem ebenfalls auf das LaSalle-Paper verwiesen wurde.

Das schien dem Fass den Boden auszuschlagen. Cremer, es war inzwischen März 2006, versuchte es ganz oben -- bei Donald Kennedy, dem Chief-Editor von Science. Er wurde keiner Antwort gewürdigt.

Für Cremer war die Angelegenheit inzwischen zu einem Thema ganz eigener Art geworden. Weit davon entfernt aufzugeben, wandte er sich mit der nun schon zum x-ten Male überarbeiteten und umgeschriebenen Richtigstellung an die Proc Natl Acad Sci U S A (PNAS) . Hier geschah das Wunder: Die lang verschmähte Refutation wurde drei Reviewern vorgelegt.

Was sagten die Reviewer? Sie waren verschiedener Meinung. Reviewer 1 forderte eine umfassendere Untersuchung der meisten geprägten (imprinted) Gencluster und einiger nicht-geprägten (non-imprinted) Kontrollregionen. Reviewer 2 forderte ebenfalls Mehrarbeit -- so sollte etwa das Centromer Clustering im Gorilla untersucht werden, des weiteren Patientenzellen. Und auch Reviewer 3 forderte einen Rattenschwanz zusätzlicher Experimente.

Mit anderen Worten: Die Referees wollten keine reine Widerlegung, sondern eigene Ergebnisse. Der PNAS-Editor lehnte das Manuskript daraufhin ab. Er war aber bereit, ein revidiertes Manuskript, das die Kritik der Reviewer berücksichtigt, noch einmal begutachten zu lassen - natürlich ohne Publikationsgarantie.

Thomas Cremer dagegen hat aber auch seinen Stolz. Er denkt nun daran, die reine Widerlegung in einem Journal mit weniger Impact zu veröffentlichen. Ein Angebot dazu hat er schon.

Cremers Lehre aus der fast zweijährigen Affäre: "Ich konnte mir diesen Testlauf leisten. Meiner fähigen Doktorandin Kathrin Teller wird er am Ende auch nicht schaden. Wir haben ja andere interessante Dinge in der Mache. Einem jungen Wissenschaftler, der noch ohne tenured position ist, etwa gerade seine erste Arbeitsgruppe aufbaut und keinen "mächtigen Max" zu seiner Unterstützung im Hintergrund hat, kann man aber nur raten:

1. Lass die Finger von Versuchen, an einem Befund herumzumäkeln, der in einem führenden Journal publiziert wurde, es könnte Deine Existenz als Wissenschaftler kosten.

2. Wenn Du an einer Karriere interessiert bist, versuche eine Big Story in einem Big Journal zu landen. Sollte sie am Ende falsch sein, was macht das schon, wenn Du durch diese Story zu Deinem ersehnten tenure gelangt bist."

Nebenbei ist das Risiko sowieso minimal, da es offenbar sehr unwahrscheinlich ist, dass die Refutation auch nur annähernd ähnlich prominent publiziert wird.

Siegfried Bär

(Der Artikel erschien zuerst unter der Überschrift "Don't Challenge a winning Paper" in unserer englischsprachigen Schwesterzeitschrift Lab Times (Vol. 3, S. 16-19).)

Letzte Änderungen: 19.10.2006