(2. November 2012) Was Liftfahren dem Treppensteigen voraus hat, ist klar: es f¸hrt schneller ans Ziel und erfordert weniger Anstrengung. Gleiches sollten kommerzielle Kits im Vergleich mit hausgemachten Protokollen leisten. Im Labor ist allerdings der Weg ¸ber die Treppe dennoch ˆfter der effektivere und billiger ist er in aller Regel sowieso.
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Nach diesem Motto stellt die Mikrobiologin Vicki Doronina von der Universit‰t Manchester auf BitesizeBio ein Protokoll f¸r hausgemachte Plasmid-Midipr‰ps vor, welches hˆhere Ausbeuten an Plasmid-DNA liefert als jeder ihr bekannte kommerzielle Midipr‰p-Kit und das meist auch noch schneller. Und so gehts:
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1) 50 ml selektives Medium mit Bakterien animpfen. Wachsen lassen.
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2) Bakterien zentrifugieren, ‹berstand abkippen. Bakterien-Pellet in 2 ml TEG-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 8,0; 2 mM EDTA, 20% Glucose) aufnehmen.
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3) 4 ml Lyse-Puffer (0,2 M NaOH; 1% w/v SDS) zugeben, Mischen durch Inversion.
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4) 2,5 ml 3 M Natriumacetat pH 5,3 zugeben, Mischen durch Inversion.
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5) F¸r 15 min. bei Hˆchstgeschwindigkeit (in der Regel rund 4.000 rpm) herunter zentrifugieren. Wenn nach der ersten Zentrifugation noch Eiklar-‰hnliche Substanzen im Rˆhrchen schwimmen und das Entfernen des ‹berstands stˆren, den Lauf nochmals wiederholen.
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6) Den ‹berstand in ein frisches Falcon-Rˆhrchen ¸berf¸hren, sofort ein gleiches Volumen Isopropanol zuf¸gen, mischen, und wiederum 15 min. lang abzentrifugieren
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7) ‹berstand verwerfen, das weifle Pellet mit 70% Ethanol waschen und an der Luft f¸r 15 min. trocken lassen.
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8) Das Pellet enth‰lt nun jede Menge RNA. Dieses daher in 0,5 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4; 1 mM EDTA pH 8,0), dem 5 µl RNAse A (10mg/ml) hinzugef¸gt wurden, aufnehmen und f¸r 30 min. bei 37 ∞C inkubieren.
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9) Die Lˆsung in ein frisches Eppendorf-Tube ¸berf¸hren und solange mit Phenol extrahieren, bis die Trennlinie zwischen der oberen und unteren Schicht klar ist (zweimal reicht in der Regel).
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10) DNA pr‰zipitieren und in 300 µl TE-Puffer resuspendieren. Die endg¸ltige DNA-Konzentration liegt in der Regel bei 2-4 µg/µl.
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Erstmals beschrieben wurde diese Art der alkalischen DNA-Extraktion in Nucleic Acids Res.†1979 Nov 24;7(6):1513-23.
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Was die Autorin allerdings selbst bem‰ngelt, ist der Reinigungsschritt mit Phenol. Schliefllich hantiert ein Jeder nur sehr ungern mit der hochgiftigen, ‰tzenden und mutagenen Fl¸ssigkeit.
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Und tats‰chlich antwortete ein Leser darauf mit folgender Alternative:
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K¸rzlich isolierte ich ein Plasmid mit der gleichen Methode nur im Minipr‰p-Maflstab. Allerdings f¸gte ich RNase A bereits zum Resuspensionspuffer (Schritt 2) hinzu und verwendete zudem Kaliumacetat anstelle von Natriumacetat, da Kalium die F‰llung von SDS verst‰rkt. Mit diesen beiden ƒnderungen konnte ich die Phenol-F‰llung vermeiden und erhielt ein sehr reines Pr‰p (5mg/ml). Eine 1:10-Verd¸nnung der Probe gab ich zum Sequenzieren und bekam richtig gute Ergebnisse.
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Weniger gesundheitsgef‰hrdend ist diese Alternative allemal. Ob sie allerdings dazu ‰hnlich gute Ausbeuten liefert, muss wohl erst noch unabh‰ngig best‰tigt werden.